1. Начальное понимание

На этом этапе нам необходимо понимать некоторые понятия и терминологию, чтобы не совершать ошибок перед старшими, например:

В: В чем разница между ОТ-ПЦР, количественной ПЦР, ПЦР в реальном времени и ОТ-ПЦР в реальном времени?

Ответ: ОТ-ПЦР — это ПЦР с обратной транскрипцией.(ПЦР с обратной транскрипцией, ОТ-ПЦР), который является широко используемым вариантом полимеразной цепной реакции (ПЦР).В ОТ-ПЦР цепь РНК обратно транскрибируется в комплементарную ДНК, которая затем используется в качестве матрицы для амплификации ДНК с помощью ПЦР.
ПЦР в реальном времени и кПЦР(Количественная ПЦР в реальном времени) - это одно и то же, обе они являются количественной ПЦР в реальном времени, что означает, что каждый цикл ПЦР имеет записи данных в реальном времени, поэтому количество начальных шаблонов можно регулировать для точного анализа.

Хотя и ПЦР в реальном времени (количественная флуоресцентная ПЦР в реальном времени), и ПЦР с обратной транскрипцией (ПЦР с обратной транскрипцией) кажутся аббревиатурой ОТ-ПЦР, международная конвенция такова: ОТ-ПЦР конкретно относится к обратной транскрипции.ПЦР, ПЦР в реальном времени обычно обозначается аббревиатурой qPCR (количественная ПЦР в реальном времени)..

И RT-PCR в реальном времени (RT-qPCR), это ПЦР с обратной транскрипцией в сочетании с флуоресцентной количественной технологией.: сначала получить кДНК (ОТ) путем обратной транскрипции РНК, а затем использовать ПЦР в реальном времени для количественного анализа (кПЦР).Большинство лабораторий проводят ОТ-кПЦР, то есть исследования подавления экспрессии РНК, поэтому кПЦР, о которой все говорят в лаборатории, на самом деле относится к ОТ-кПЦР, но не забывайте, что существует еще много ДНК-тестов в клиническом применении.Количественный анализ, например обнаружение вируса гепатита В HBV.

Вопрос: После прочтения большого количества флуоресцентных количественных ПЦР, почему амплифицированный фрагмент должен контролироваться в диапазоне 80-300 п.н.?

Отвечать: Длина последовательности каждого гена различна, некоторые составляют несколько т.п.н., некоторые сотни п.н., но при разработке праймеров нам нужно только, чтобы длина продукта составляла 80-300 п.н., слишком короткие или слишком длинные не подходят для флуоресцентной количественной ПЦР.Фрагмент продукта слишком короткий, чтобы его можно было отличить от праймера-димера.Длина праймер-димера составляет около 30-40 п.н., и трудно отличить, является ли он праймером-димером или продуктом, если он меньше 80 п.н.Если фрагмент продукта слишком длинный, превышающий 300 п.н., это легко приведет к низкой эффективности амплификации и не сможет эффективно определить количество гена.

Например, когда вы считаете, сколько людей в классе, вам нужно только посчитать, сколько там ртов.То же самое верно, когда вы обнаруживаете гены, вам нужно только обнаружить определенную последовательность гена, чтобы представить всю последовательность.Если вы хотите посчитать людей, вам нужно посчитать и рты, и носы, и уши, и очки, а ошибиться легко.

Чтобы расширить, в биологических исследованиях есть много случаев исследования от точки к области, потому что последовательность генов любого вида очень длинная, нет необходимости и невозможно измерять все фрагменты, такие как бактериальное 16S секвенирование, которое заключается в проведении консервативной последовательности анализов бактерий для определения количества определенной популяции бактерий.

В: Какова оптимальная длина праймера для количественной ПЦР?

Отвечать: Вообще говоря, длина праймера составляет около 20-24 пар оснований, что лучше.Конечно, мы должны обращать внимание на значение TM праймера при разработке праймера, потому что это связано с оптимальной температурой отжига.После множества экспериментов было доказано, что 60°C является лучшим значением TM.Если температура отжига слишком низкая, это легко приведет к неспецифической амплификации.Если температура отжига слишком высока, эффективность усиления будет относительно низкой, пик кривой усиления начнется позже, и значение CT будет задержано.

В: Чем метод окрашивания отличается от зондового метода?

Ответ: Метод окрашивания.Некоторые флуоресцентные красители, такие как SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO и т. д., сами по себе не излучают свет, но будут излучать флуоресценцию после связывания с малой бороздкой двухцепочечной ДНК.Поэтому в начале реакции ПЦР машина не может обнаружить флуоресцентный сигнал.Когда реакция достигает стадии отжига-удлинения, двойная цепь раскрывается, и под действием ДНК-полимеразы синтезируется новая цепь, и флуоресцентная молекула связывается с малой бороздкой двухцепочечной ДНК.По мере увеличения количества циклов ПЦР все больше и больше красителей объединяются с двухцепочечной ДНК, и флуоресцентный сигнал также постоянно усиливается.Метод красителя в основном используется в научных исследованиях.
PS: Будьте осторожны при проведении эксперимента, краситель должен быть объединен с ДНК человека, будьте осторожны, чтобы превратить его в флуоресцентного человека.

Метод окрашивания (слева) Метод зонда (справа)
PS: Будьте осторожны при проведении эксперимента, краситель должен быть объединен с ДНК человека, будьте осторожны, чтобы превратить его в флуоресцентного человека.

SYBR Green Ⅰ связывается с малой бороздкой ДНК.

Зондовый методЗонд Taqman является наиболее часто используемым зондом для гидролиза.На 5'-конце зонда находится флуоресцентная группа, обычно FAM, а сам зонд представляет собой последовательность, комплементарную гену-мишени.На 3'-конце находится группа гашения флуоресценции.В соответствии с принципом резонансной передачи энергии флуоресценции (резонансный перенос энергии Фёрстера, FRET), когда возбуждаются репортерная флуоресцентная группа (донорная флуоресцентная молекула) и гасящая флуоресцентная группа (акцепторная флуоресцентная молекула).Следовательно, в начале реакции ПЦР, когда зонд свободен и не поврежден в системе, репортерная флуоресцентная группа не будет излучать флуоресценцию.При отжиге праймер и зонд связываются с матрицей.На стадии удлинения полимераза непрерывно синтезирует новые цепи.ДНК-полимераза обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью.Достигнув зонда, ДНК-полимераза гидролизует зонд из матрицы, отделяет репортерную флуоресцентную группу от флуоресцентной группы гасителя и высвобождает флуоресцентный сигнал.Поскольку между зондом и матрицей существует взаимосвязь один к одному, метод зонда превосходит метод красителя с точки зрения точности и чувствительности теста.Зондовый метод в основном используется в диагностике.

В: Что такое абсолютная количественная оценка?Что такое относительная количественная оценка?

Отвечать: Абсолютная количественная оценка относится к расчету исходного количества копий образца, подлежащего тестированию с помощью количественной ПЦР, например, количества вирусов HBV в 1 мл крови.Результат, полученный с помощью относительного количественного определения, представляет собой изменение количества целевого гена в конкретном образце по отношению к другому эталонному образцу, причем экспрессия гена регулируется вверх или вниз.

В: Повлияют ли на результаты эксперимента количество выделенной РНК, эффективность обратной транскрипции и эффективность амплификации?
В: Повлияют ли хранение образцов, реагенты для экстракции, реагенты для обратной транскрипции и светопропускающие расходные материалы на результаты эксперимента?
В: Каким методом можно исправить экспериментальные данные?

Что касается этих проблем, мы подробно опишем их в разделах «Дополнительно» и «Дополнительно» ниже.
2. Продвинутые знания

Что касается количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени, мы должны признать тот факт, что каждый год публикуются тысячи научных работ, среди которых немалая доля принадлежит технологии количественной флуоресцентной ПЦР.

Если нет общего стандарта для измерения флуоресцентного количественного ПЦР, результаты могут сильно различаться.Для одного и того же гена одного и того же вида с одним и тем же методом обработки результаты обнаружения также будут сильно различаться, и опоздавшим будет трудно повторить те же результаты.Вы Никто не знает, что правильно, а что нет.

Означает ли это, что флуоресцентная количественная ПЦР — технология обмана или ненадежная технология?Нет, потому что флуоресцентная количественная ПЦР более чувствительна и точнее, а небольшая неправильная операция даст совершенно противоположные результаты.Небольшая потеря за тысячу миль.Автор статьи может неоднократно подвергаться пыткам со стороны рецензентов.В то же время рецензентам журнала также сложно выбирать из разных экспериментальных результатов.

В целом, это указывает на отсутствие консенсуса в экспериментах ПЦР в реальном времени.С этой целью ведущие ученые отрасли начали формулировать стандарты,требование к участникам предоставить некоторые необходимые сведения об экспериментах и ​​обработке данных (включая необходимые данные) в статье, чтобы соответствовать этим стандартам.

Рецензенты могут судить о качестве эксперимента, прочитав эти детали;будущие читатели также могут использовать это, чтобы повторить эксперимент или улучшить его.Тогда экспериментальные результаты, полученные таким образом, будут информативными, качественными и пригодными для использования.

MIBBI (минимум информации для биологических и биомедицинских исследований -http://www.mibbi.org) возникло.MIBBI — это проект, предоставляющий стандарты для экспериментов..Он опубликован в природе.Этот проект направлен на различные биологические эксперименты, в том числе на клеточную биологию, микрочип, количественную ПЦР, о которых мы сейчас поговорим, и т. д., и предусматривает каждый тип эксперимента при подаче рукописи.Эта информация должна предоставляться в любое время.

В проекте MIBBI есть две статьи, связанные с флуоресцентной количественной ПЦР, а именно:
·RDML (язык разметки данных ПЦР в реальном времени) – структурированный язык и руководство по отчетности для количественных данных ПЦР в реальном времени;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) — минимальная информация для публикации статей о количественных ПЦР-экспериментах в реальном времени.
Во-первых, давайте поговорим о RDML, спецификации терминологии.

Если для всего нет стандартного определения, то невозможно продолжать обсуждение, поэтому объяснение терминов так важно на экзамене.
Терминология, используемая в эксперименте по флуоресцентной количественной ПЦР, включает следующее содержание.QIAGEN сделала для нас наилучшее резюме.Следующие все сухиетовары .

Кривая усиления
Кривая амплификации представляет собой кривую, полученную в процессе ПЦР, с номером цикла по оси абсцисс и интенсивностью флуоресценции в реальном времени во время реакции по оси ординат.

Отличная кривая усиления должна иметь следующие характеристики:: базовая линия плоская или немного снижена, и нет явного восходящего тренда;точка перегиба кривой четкая, а наклон экспоненциальной фазы пропорционален эффективности усиления.Чем больше наклон, тем выше эффективность усиления;общая кривая усиления. Параллелизм хороший, что указывает на одинаковую эффективность усиления каждой лампы;очевидна экспоненциальная фаза кривой усиления низкоконцентрированных образцов.

Базовый уровень (базовый уровень)
Базовым уровнем является уровень шума в начале цикла., обычно измеряемый между 3-м и 15-м циклами, потому что увеличение значения флуоресценции, вызванное продуктом амплификации, не может быть обнаружено в этот период.Количество циклов, используемых для расчета базового уровня, может варьироваться, и его может потребоваться уменьшить, если используются большие количества матрицы или если уровень экспрессии целевого гена высок.

Установка базовой линии требует просмотра данных флуоресценции по кривой усиления линейности.Базовый уровень устанавливается таким образом, чтобы рост кривой амплификации начинался с номера цикла, превышающего верхний номер цикла базового уровня.Базовые уровни должны быть установлены индивидуально для каждой целевой последовательности.Средние значения флуоресценции, обнаруженные в ранних циклах, необходимо вычесть из значений флуоресценции, полученных в продуктах амплификации.Последние версии различных программ для ПЦР в реальном времени позволяют автоматически оптимизировать базовые настройки для отдельных образцов.

В течение первых нескольких циклов реакции амплификации ПЦР сигнал флуоресценции практически не меняется.Приближение к прямой линии называется базовой линией, но если мы внимательно посмотрим на первые несколько циклов, мы увидим, что в пределах базовой линии происходит то, что показано на рисунке ниже.

Фон Фон относится к
значение неспецифической флуоресценции в реакции.Например: неэффективное тушение флуоресценции;или большое количество матриц двухцепочечной ДНК из-за использования SYBR Green.Фоновые компоненты сигнала математически удаляются программным алгоритмом ПЦР в реальном времени.

Сигнал репортера
Репортерный сигнал относится к флуоресцентному сигналу, генерируемому SYBR Green или флуоресцентно мечеными специфическими для последовательности зондами во время ПЦР в реальном времени.

Нормализованный репортерный сигнал (RN)
RN относится к интенсивности флуоресценции репортерного красителя, деленной на интенсивность флуоресценции пассивного эталонного красителя, измеренную в каждом цикле.

Пассивный эталонный краситель
В некоторых ПЦР в реальном временифлуоресцентный краситель ROX используется в качестве внутреннего эталона для нормализации флуоресцентного сигнала.Он корректирует отклонения, вызванные неточным пипетированием, положением лунок и колебаниями флуоресценции для каждой лунки.

Порог флуоресценции (порог)
был отрегулирован выше фонового значения и значительно ниже значения плато кривой усиления.Он должен лежать в линейной области кривой амплификации, представляя логарифмически линейный диапазон обнаружения ПЦР.Пороги должны быть установлены в представлении кривой логарифмической амплификации, чтобы можно было легко идентифицировать логарифмически линейную фазу ПЦР.Если в ПЦР в реальном времени имеется несколько генов-мишеней, порог должен быть установлен для каждой мишени.Как правило, сигнал флуоресценции первых 15 циклов реакции ПЦР используется в качестве фонового сигнала флуоресценции, а порог флуоресценции в 10 раз превышает стандартное отклонение сигнала флуоресценции первых 3-15 циклов ПЦР, а порог флуоресценции устанавливается в экспоненциальной фазе амплификации ПЦР.Как правило, для каждого прибора перед использованием устанавливается порог флуоресценции.

Порог цикла (CT) или точка пересечения (CP)
Цикл, при котором кривая амплификации пересекает порог (т. е. точку, в которой значительно увеличивается детектирование флуоресценции).CT может быть дробью, и можно рассчитать количество исходного шаблона.Значение CT представляет собой количество циклов, когда флуоресцентный сигнал в каждой реакционной пробирке для ПЦР достигает установленного порога.Существует линейная зависимость между значением CT каждого шаблона и логарифмом исходного числа копий шаблона, т.е.чем выше начальный номер копии, тем меньше значение CT, и наоборот.Стандартную кривую можно построить, используя стандарт с известным исходным числом копий, где абсцисса представляет значение CT, а ордината представляет собой логарифм исходного числа копий.Следовательно, если получено значение CT неизвестного образца, начальное количество копий образца можно рассчитать по стандартной кривой.

ΔCT значение
Значение ΔCT описываетразница между целевым геном и соответствующим значением СТ эндогенного эталонного гена, такой как ген домашнего хозяйства, и используется для нормализации количества используемого шаблона:
⇒ΔCT = CT (ген-мишень) – CT (эндогенный эталонный ген)

ΔΔCT Значение
Значение ΔΔCT описывает разницу между средним значением ΔΔCT интересующего образца (например, стимулированных клеток) и средним значением ΔΔCT эталонного образца (например, нестимулированных клеток).Эталонный образец также называется калибровочным образцом, и все остальные образцы нормализуются к нему для относительного количественного определения:
⇒ΔΔCT = среднее ΔCT (исследуемый образец) – среднее ΔCT (эталонный образец)

Эндогенные эталонные гены (эндогенные эталонные гены)
Уровни экспрессии эндогенных эталонных генов, таких как гены домашнего хозяйства (гены домашнего хозяйства), не различаются между образцами.Сравнение значений CT эталонного гена с геном-мишенью позволяет нормализовать уровень экспрессии гена-мишени к количеству вводимой РНК или кДНК (см. раздел о значениях ΔCT выше).

Внутренние эталонные гены корректны длявозможная деградация РНК или присутствие ингибиторов ферментов в образцах РНК, а также различия в содержании РНК, эффективности обратной транскрипции, извлечении нуклеиновых кислот и обращении с образцами.Чтобы выбрать оптимальный эталонный ген (гены), мы модифицировали алгоритм, чтобы он мог выбирать оптимальный эталонный ген в зависимости от условий эксперимента.

Внутренний контроль
Контрольная последовательность, которая амплифицируется в той же реакции, что и последовательность-мишень, и зондируется другим зондом (т. е. при проведении дуплексной ПЦР).Внутренний контроль часто используется, чтобы исключить неудачные амплификации, например, когда целевая последовательность не обнаружена.
Калибровочный образец
Эталонный образец (например, очищенная РНК из клеточной линии или ткани), используемый в относительном количественном определении для сравнения всех других образцов для определения относительного уровня экспрессии гена.Калибровочным образцом может быть любой образец, но обычно это контроль (например, необработанный образец или образец с нулевого момента эксперимента).

Положительный контроль
использовать контрольные реакции сизвестное количество шаблона.Положительные контроли часто используются для проверки правильности работы набора праймеров или набора праймер-зонд и правильности проведения реакции.

Без управления шаблоном (NTC)
Контрольная реакция, содержащая все необходимые компоненты реакции амплификации, кроме темплата, который обычно заменяют водой.Использование NTC может обнаружить загрязнение, вызванное загрязнением реагентом или чужеродной ДНК, что обеспечивает достоверность и надежность данных обнаружения.Усиление контроля NTC указывает на загрязнение.

Без контроля RT (NRT)
Процесс выделения РНК может содержать остаточную геномную ДНК, которая чрезвычайно вредна и является виновником, влияющим на качество данных, и естественным врагом количественной ПЦР, поэтому при планировании экспериментов он должен быть разработан только для усиления обнаружения РНК.Есть два пути: один — сконструировать праймеры для интронов, другой — полностью удалить ДНК, какой из них лучше, об этом мы поговорим позже.Контроль NTR — это волшебное зеркало для обнаружения загрязнения ДНК.Если есть усиление, значит есть загрязнение.

Стандарты
Стандарты представляют собой образцы с известной концентрацией или числом копий, которые используются для построения стандартной кривой.Для обеспечения стабильности стандарта фрагмент гена обычно клонируют в плазмиду и используют в качестве стандарта.

Стандартная кривая
обычно разбавляют по крайней мере до 5 градиентов концентрации со стандартным продуктом в соответствии с коэффициентом удвоения, и 5 точек рисуются в координатах значения CT и числа копий, и точки соединяются, чтобы сформировать линию для создания стандартной кривой.Для каждой стандартной кривой необходимо проверить ее достоверность.Значение наклона колеблется между –3,3 и –3,8, и каждую концентрацию выполняют трижды.Точки, которые значительно отличаются от других точек, должны быть отброшены.Значение CT тестируемого образца помещается на стандартную кривую, после чего можно рассчитать уровень экспрессии тестируемого образца.

Значение CT испытуемого образца наносится на стандартную кривую, после чего можно рассчитать начальное количество копий испытуемого образца.

Эффективность и наклон
Наклон стандартной кривой представляет собой эффективность ПЦР в реальном времени.
· Наклон -3,322 указывает на то, что эффективность амплификации ПЦР равна 1, или 100% эффективности, а количество продукта ПЦР удваивается в каждом цикле.
· Наклон менее –3,322 (например, –3,8) указывает на эффективность ПЦР.
· Наклон больше -3,322 (например, -3,0) указывает на то, что эффективность ПЦР кажется выше 100%, что любопытно, как мог один цикл ПЦР генерировать более чем вдвое больше амплифицированного продукта?Такая ситуация имеет место в нелинейной фазе реакции ПЦР, то есть имеет место большое количество неспецифической амплификации.

кривая плавления
После завершения количественной ПЦР продукт ПЦР нагревают.По мере повышения температуры двухцепочечный продукт амплификации постепенно плавится, что приводит к снижению интенсивности флуоресценции.При достижении определенной температуры (Tm) расплавится большое количество продуктов.Флуоресценция резко падает.Различные продукты ПЦР имеют разные значения Tm и разные температуры плавления, так что можно определить специфичность ПЦР.

Кривая плавления (производная кривая)
Кривая плавления выводится для формирования карты пиков, которая может более интуитивно отображать положение фрагментов продукта ПЦР.Поскольку температура плавления представляет собой значение Tm фрагмента ДНК, можно судить о некоторых параметрах, влияющих на значение Tm фрагмента ДНК, таких как размер фрагмента, содержание GC и т. д. Вообще говоря, согласно нашим принципам разработки праймеров,длина амплифицированного продукта находится в диапазоне 80-300 п.н., поэтому температура плавления должна быть между 80°С и 90°С.

Интерпретация кривой плавления: Если единственный основной пик появляется между 80°C-90°C, это означает, что флуоресцентная количественная ПЦР безупречна;если основной пик появляется при температуре от 80°C до 90°C, а другие пики появляются при температуре ниже 80°C, в основном рассматривается димер праймера.Вы можете попытаться увеличить температуру отжига, чтобы решить эту проблему;если основной пик появляется между 80°C-90°C, а дополнительный пик снова появляется при повышении температуры, то в основном считается, что имеет место загрязнение ДНК, и ДНК необходимо удалить на начальном этапе эксперимента.

Конечно, есть еще некоторые нештатные ситуации, которые будут разбиты по порядку ниже.
3. Продвинутые знания

Чтобы сделать qPCR, я должен сказать MIQE,Минимум информацииза публикациюКоличественныйПЦР в реальном времениЭксперименты — минимум информации для публикации статей о количественной ПЦР в реальном времени.эксперименты.Чтобы упростить понимание каждого, мы упростим ключевое содержание.

Исходный текст MIQE можно поискать в Интернете, и самое главное, что в нем оговариваетсяконтрольный список данных, который необходимо предоставить при публикации статьи .

Рецензенты могут судить о качестве эксперимента, прочитав эти детали;будущие читатели также могут использовать это, чтобы повторить или улучшить эксперимент.
Стоит отметить, что в этом списке важность каждого списка отмечена буквой E или D соответственно.Что это значит?E: основная информация (должна быть представлена);D: желаемая информация (предоставьте как можно больше).

MIQE (1) — Экспериментальный план
Многие отморозки, защитившиеся после окончания аспирантуры, не будут знать, как самостоятельно спланировать эксперимент, открыть свои тетради и сделать то, что им скажет преподаватель.В результате схема эксперимента не была строгой, и редакция журнала заявила, что хотят придумать ту картинку и ту картинку, поэтому сделали это в оцепенении.Вот так и делаются отморозки!

Ближе к дому первый принцип эксперимента состоит в том, чтобы определитьстрогость экспериментальной логики.Самое главное — это план эксперимента, а самое важное в плане эксперимента — это то, как установить целевой образец, эталонный образец (контроль) и количество повторений, чтобы экспериментальные данные можно было сопоставить, сравнить и убедить.

Целевой образецотносится к образцу, который требует от нас обнаружения гена-мишени после определенной обработки.Эталонный образецпредставляет собой образец без какой-либо обработки, который в биологии часто называют диким типом.

Экспериментальные повторыочень важны.Как правило, количество убедительных повторов должно быть больше трех.Необходимо различать, что такое биологическая репликация и что такое техническая репликация.

Биологические реплики: Один и тот же проверочный эксперимент с разными материалами (время, растения, партии, реакционные пластины).

Биологическое дублирование
Возьмем в качестве примера обработку перца пестицидами.Мы хотим распылить пестициды на три растения ABC, тогда три растения ABC представляют собой три биологических повторения, и они представляют собой один и тот же проверочный эксперимент, проведенный с разными материалами.Но в качестве эксперимента обязательно нужен контроль, поэтому мы можем опрыскивать одну из ветвей растения А, чтобы сформировать экспериментальную группу растения А, а не опрыскивать другие ветви растения А, чтобы сформировать контрольную группу.Сделайте то же самое для B и C.

Технические реплики (Технические реплики): Это повторяющийся эксперимент, предназначенный для предотвращения ошибок, вызванных операцией, которая на самом деле является дублирующим отверстием, включенным в один и тот же материал.И обработка, и контроль должны иметь повторяющиеся настройки (минимум три) целевого гена и внутреннего эталонного гена.

Техническое повторение
В качестве примера снова возьмем перец, обработанный пестицидами.Для экспериментальной группы растения А мы сделали три отверстия ПЦР 1, 2 и 3 для его гена-мишени и внутреннего эталонного гена соответственно, чтобы получить среднее значение после обнаружения.Таким же образом обрабатывают группы А для контроля растений.Точно так же проделайте ту же обработку для растений B и C.Это техническое повторение.

Стоит отметить, чточто входит в статистику, так это биологическое повторение, а техническое повторение должно проверять, есть ли какие-либо случайные явления в экспериментальном процессе, чтобы сделать результаты эксперимента достоверными, то есть избежать ошибок, взяв их среднее значение, как мы часто говорим.

Отрицательный контроль — NTC и NRT
NTC (управление без шаблона), контроль без шаблона, используется для проверки того, загрязнен ли экспериментальный материал.Как правило, в качестве шаблона используется вода.Если есть флуоресцентная реакция, это указывает на то, что в лаборатории произошла контаминация нуклеиновой кислотой.

Эти загрязнения происходят из-за: нечистой воды, неподходящих реагентов, содержащих эндогенную ДНК, загрязнения праймеров, загрязнения лабораторного оборудования, аэрозольного загрязнения и т. д., необходимо использовать поглотители РНКазы и ингибиторы РНКазы.Аэрозольное загрязнение обнаружить труднее всего.Представьте, что ваша лаборатория подобна смогу с различными нуклеиновыми кислотами, взвешенными в воздухе.

НЗТ (без обратной транскриптазы), контроль без обратной транскрипции, представляет собой РНК без обратной транскрипции в качестве отрицательного контроля, который является контролем остатка гДНК.

При экспрессии генов количество РНК определяется путем определения количества кДНК после обратной транскрипции.Если при очистке РНК есть остаток гДНК, это вызовет ошибки в экспериментальных результатах, потому что фактически полученные результаты представляют собой гДНК и кДНК.На уровне агрегатов, а не только кДНК, гДНК необходимо полностью удалить во время выделения РНК.

MIQE (2) — образец информации
Так называемая информация об образце означает, что когда мы публикуем статью о количественной ПЦР, мы должны четко объяснить информацию об образце, что является неотъемлемой частью статьи.Точно так же, когда мы обрабатываем образцы, мы также должны регулировать наши собственные операции, чтобы гарантировать достоверность образцов.

Описание пробы является лишь результатом, и следует больше внимания уделять материалам, взятым в ходе всего эксперимента.

Подбор экспериментальных материалов
Образцы крови – выбирайте свежую кровь, не более 4 часов.Образцы клеток — выбирайте свежие клетки в период активного роста.Ткани животных — выбирайте свежие, активно растущие ткани.Растительная ткань – выбирайте свежую, молодую ткань.

Вы, должно быть, заметили, что в этих нескольких предложениях есть ключевое слово: свежий.
Для вышеуказанных образцов лучшим, экономичным и стабильным набором на рынке является набор Foregene, с помощью которого можно быстро и легко выделить их ДНК и РНК.

Мини-набор ДНК крови

Набор для выделения общей клеточной РНК

Набор для выделения тотальной РНК животных

Набор для выделения общей РНК растений

Комплект для выделения общей РНК растений Plus

Набор для выделения ДНК растений

Хранение экспериментальных материалов
Вообще говоря, мы не рекомендуем хранить образцы, если позволяют условия.Однако есть много знакомых, которые не могут проводить эксперименты сразу после отбора проб, а некоторым даже приходится нести в поле емкости с жидким азотом для отбора проб.

Для такого трудолюбивого друга могу только сказать, что вы не разбираетесь в расходных материалах реагентов.В настоящее время многие компании, производящие расходные материалы для реагентов, производят реагенты, в которых можно хранить образцы РНК при комнатной температуре, и вы можете использовать их по своему усмотрению.Традиционным методом хранения является хранение жидкого азота с использованием небольшого резервуара с жидким азотом, который легко носить с собой.После доставки образца в лабораторию храните его в холодильнике при температуре -80°C.

Для экспериментов с РНК необходимо соблюдать принцип шести слов:низкая температура, отсутствие ферментов,ибыстрый .

Понятие низкой температуры легко понять;без ферментов РНКаза присутствует повсюду в мире, в котором мы живем (иначе вас бы убил ВИЧ), так что как избежать РНКазы при проведении экспериментов — очень важная концепция;быстрый,В мире нет кунг-фу, которое нельзя сломать, нельзя сломать только скорость.

Следовательно, в некотором смысле, чем короче время экстракции, тем лучше набор.ПочемуФорегенев комплекте делают упор на скорость, потому что знают ее хорошо.

PS: Некоторые девушки очень осторожно проводят эксперименты, но они не так хороши, как слэм-данк после нескольких лет работы.Они чувствуют, что Бог несправедлив, жалуются на других и ищут жизни.На самом деле она этого не понимала.Он плохо защищал РНК, а игрок в слэм-данк был проворным.Когда он проводил эксперимент, он думал, что завершит слэм-данк с тремя, пятью и двумя делениями, но он провел эксперимент хорошо.

Примечание: Медленнее, больше шансов на вторжение РНКазы.Как приучить себя быть быстрым?Нет никакого способа, просто больше тренируйтесь.

Для разных экспериментов и разных образцов все равно необходимо читать больше литературы и выбирать подходящий метод обработки.Что касается процесса сбора и хранения образцов, MIQE требует, чтобы это было четко написано в документе, чтобы рецензенты могли проверить надежность документа, а ошеломленным подросткам также было удобно повторить ваш эксперимент.

Хотя биологические эксперименты сложны, они сложны.Если вы не будете осторожны, вы можете перевернуть мир.Например, превратить атипичную пневмонию в биохимический кризис или создать гибридный рис, чтобы спасти 1,3 миллиарда человек.Изображение ниже представляет собой химический эксперимент, вы должны понять, как гордитесь своими исследованиями, просто взглянув на его членоподобный вид.Забудь, не черни его.

MIQE (3) – экстракция нуклеиновых кислот.
Выделение нуклеиновых кислот — большое событие, и все эксперименты по молекулярной биологии начинаются с выделения нуклеиновых кислот.Прежде всего, давайте скопируем содержимое MIQE по извлечению нуклеиновых кислот.

Глядя на эту форму, нельзя оставаться на поверхности.Форма — это догма.Чтобы быть лучшим учеником, вы должны спросить, почему.Основное содержание этой таблицы:чистота, целостность, консистенция и экстрагируемое количество РНК .

Первая частьпроцесс или инструмент является этапом выделения нуклеиновой кислоты.Если вы используете для извлечения автоматический экстрактор нуклеиновых кислот (дополнительно, пожалуйста, свяжитесь со мной для покупки), вам необходимо указать название модели прибора.

Название комплекта и

какой набор был использован для деталей изменения, какие специальные реагенты были добавлены или какие специальные операции были выполнены, должны быть четко объяснены, чтобы другие могли легко повторить ваш эксперимент.

Некоторые люди добавляют какие-то специальные реагенты при извлечении особых образцов, думая, что это их секретное оружие и никому не говорят.Сохраняя это в секрете, они также теряют возможность сделать вашу статью блестящей.Не будь умным, ты должен быть честнее, чем деревенский старик Чжан в научных исследованиях, если ты хочешь быть умным, статья сделает тебя глупым.

необходимо запомнить артикул комплектапри заказе комплекта и написании статьи.Обычно на наборе есть два номера: Cat — каталожный номер (номер продукта, номер артикула), Lot — номер партии продукта (используется для обозначения того, из какой партии был продукт).

Кроме того, номер CAS часто используется при заказе биохимических реактивов, и я буду популяризировать его вместе.Номер CAS — это номер, который Американское химическое общество присваивает каждому новому химическому лекарству.Как правило, три числа соединяются тире.Номер CAS Rushui: 7732-18-5.Химические вещества часто имеют несколько псевдонимов, но номер CAS уникален.При заказе лекарства вы можете сначала проверить его номер CAS.

Ближе к дому, почему мы должны четко описывать эти вещи?По сути, это еще и проверка качества выделения РНК.Использование инструментов и наборов сделает извлечение РНК более последовательным.Шкала добычи обычных лабораторий невелика, и ее можно получить с помощью наборов.

Детали лечения ДНКазой или РНКазой
Важной проблемой флуоресцентной количественной ПЦР является предотвращение загрязнения ДНК и отказ от экспериментов в случае загрязнения.Поэтому крайне важно указать процесс, который вы использовали для обработки ДНК, чтобы продемонстрировать, что ДНК в экспериментальном процессе была полностью удалена.представлен схематической схемой.

Схематическая диаграмма РНК и ДНК
В общем, метод удаления ДНК заключается в обработке РНК ДНКазой после экстракции.Однако это относительно старые методы.Коммерческие наборы для выделения РНК способны удалять ДНК в процессе экстракции без добавления ДНКазы.Например, серия комплектов от Foregene.

Примечание: Удаление ДНК во время выделения РНК — это очень опасный обоюдоострый меч, который продлит время операции выделения РНК и повысит риск деградации РНК.По сути, это компромисс между выходом РНК и ее чистотой.

Кроме того, количество ДНКазы, добавляемой в адсорбционную колонку на основе диоксида кремния, очень мало, и для достижения эффекта необходимо использовать высококачественную ДНКазу.Неоптимизированная ДНКаза не может быть переварена быстро и полностью.Это проверка технического уровня торговца.Конечно, есть еще более странные торговцы, которые хвастаются, что ДНК можно удалить без ДНКазы.Можно сказать, что любой, кто хвастается, что ДНК можно полностью удалить без ДНКазы, — хулиган.ДНК представляет собой относительно стабильную двухцепочечную структуру, и ее нельзя уничтожить, просто разговаривая и смеясь.

Оценка загрязнения
Метод оценки: обнаружение электрофорезом, 1% агароза, 6 В/см, 15 мин, загрузка 1-3 мкл.

Количественный анализ нуклеиновых кислот
обычно измеряют с помощью УФ-спектрофотометра.Позвольте мне сначала популяризировать значение трех значений OD260, OD280 и OD230.
· OD260nm: это длина волны поглощения самого высокого пика поглощения нуклеиновой кислоты, и наилучшее измеренное значение колеблется от 0,1 до 1,0.Если нет, разбавьте или сконцентрируйте образец, чтобы привести его в диапазон.
·OD280nm: Это длина волны поглощения самого высокого пика поглощения белковых и фенольных веществ.
·OD230nm: Это длина волны поглощения самого высокого пика поглощения углеводов.

Далее поговорим о роли каждого индикатора.Для A260 его можно использовать для измерения выхода нуклеиновой кислоты.Когда OD260=1, дцДНК=50 мкг/мл, одноцепочечная ДНК=37 мкг/мл, РНК=40 мкг/мл.

Для чистоты нам нужно посмотреть на соотношения, которые мы обычно видим: OD260/280 и OD260/230.
·Чистая ДНК: OD260/280 приблизительно равна 1,8.Когда он больше 1,9, это указывает на загрязнение РНК, а когда он меньше 1,6, это указывает на загрязнение белками и фенолами.
·Чистая РНК: 1,7
·OD260/230: Будь то ДНК или РНК, эталонное значение равно 2,5.Когда он меньше 2,0, это указывает на загрязнение сахаром, солью и органическими веществами.

целостность РНК

Очень важно измерить целостность РНК.Как правило, необходимо провести эксперимент с денатурацией РНК в геле, чтобы проверить, является ли яркость между 28S и 18S РНК двукратной зависимостью.Когда появляется третья полоса 5S, это означает, что РНК начала деградировать, за исключением беспозвоночных.

Данные для оценки качества РНК. В дополнение к вышеперечисленным тестам существуют также более продвинутые инструментальные тесты с точки зрения целостности РНК, такие как тест целостности RQI автоматической системы электрофореза Experion, который может определить, расщепляется ли РНК незаметно.

В научных исследованиях флуоресцентная количественная ПЦР представляет собой сравнение между целевым геном и внутренним эталонным геном.Следовательно, в процессе сохранения образцов РНК, выделения РНК и т. д. основной целью является обеспечение целостности РНК.

Как целостность РНК влияет на баланс между геном-мишенью и внутренним эталонным геном, легко понять из рисунка ниже.Деградация приведет к неполноте гена, будь то неполнота внутреннего эталонного гена или неполнота гена-мишени, она окажет большое влияние на данные.

Схематическая диаграмма целевого гена и эталонного гена не должна быть правдой.

Тест на ингибирование (независимо от того, подавляется ли значение CT при высокой или низкой концентрации или в других условиях)

Взяв этот рисунок в качестве примера, значения Ct пяти кривых следующие.Распределение значений CT между кривыми неравномерно, а значения Ct запаздывают при высоких и низких концентрациях, что является случаем ингибирования ПЦР.

Ключевой момент: в процессе выделения РНК нам необходимо отказаться от заблуждений и установить правильные.

Неверная идея: экстракция РНК преследует только выход, полагая, что чем больше количество полученной РНК, тем лучше.На самом деле, когда мы проводим количественную оценку, если количество генов не очень велико, нам не нужно много РНК.Количество РНК, которое вы извлекаете, более чем достаточно.

Правильная концепция:Экстракция РНК должна обеспечивать чистоту, целостность и согласованность.Чистота может гарантировать, что последующая обратная транскрипция не будет ингибирована, и ДНК не повлияет на данные.Целостность обеспечивает баланс целевых последовательностей и внутренних ссылок.Постоянство обеспечивает стабильную загрузку образца.

MIQE (4) – обратная транскрипция
Заблуждение: стремление к большему объему выборки.
Правильная концепция: Стремитесь к согласованности (стабильности), независимо от количества загруженной РНК, эффективность обратной транскрипции остается неизменной, гарантируя, что различия в кДНК действительно могут отражать различия в мРНК.
Поясним этот процесс схематической схемой:

Схематическая диаграмма эффективности обратной транскрипции, не соответствует действительности
Прежде всего, нам нужно понять разницу между процессом обратной транскрипции и процессом ПЦР.ПЦР подвергается многократным процессам нагрева и отжига, и целевой фрагмент растет экспоненциально;в то время как обратная транскрипция не имеет этого процесса, мы можем представить, что обратная транскрипция на самом деле является взаимно однозначной. В процессе репликации столько фрагментов РНК

так как можно получить столько фрагментов информации кДНК, это должно быть понято уже сейчас, потому что большие и малые фрагменты были подвергнуты обратной транскрипции, и невозможно сосредоточиться на одном фрагменте.И поскольку количество РНК относительно невелико, количество полученной кДНК также относительно невелико, в отличие от ПЦР, которая имеет эффект амплификации, поэтому ее практически невозможно обнаружить.

результаты электрофореза кДНК
Во-вторых, в идеале обратная транскрипция выполняется один к одному, но ни одна обратная транскриптаза ни одной фирмы не может добиться такого эффекта.В основном эффективность большинства обратных транскриптаз колеблется в пределах 30-50%.Если это так, то мы предпочли бы иметь относительно стабильную эффективность обратной транскрипции, что мы и хотим видеть на рисунке: 3 РНК получают 2 кДНК, 6 РНК получают 4 кДНК, поэтому независимо от того, сколько образца загружено, эффективность обратной транскрипции относительно стабильна.Мы не хотим видеть ситуацию, когда эффективность обратной транскрипции нестабильна, а высокая концентрация подавляется.

Итак, как проверить, стабильна ли эффективность обратной транскрипции?Метод очень прост, вам нужно всего лишь провести сравнительный тест: один — выполнить обратную транскрипцию в кДНК после удвоения разведения РНК, а другой — сделать удвоение разведения после обратной транскрипции в кДНК, а затем провести КПЦР, чтобы увидеть полученный наклон. Согласен ли он.Как лучший ученик, вы должны понять это за секунды.Как показано ниже:

Разведение РНК и кДНК для проверки стабильности эффективности обратной транскрипции
Обратная транскриптаза и комплект
Как совершенная флуоресцентная количественная ПЦР может иметь превосходную обратную транскриптазу и комплект.Обратная транскриптаза условно делится на два типа в зависимости от источника: AMV илиМ-МЛВ, а их производительность такая же, как показано в таблице.

активность РНКазы H
РНКаза Н — это рибонуклеаза Н, китайское название — рибонуклеаза Н, которая представляет собой эндорибонуклеазу, способную специфически гидролизовать РНК в гибридной цепи ДНК-РНК.РНКаза H не может гидролизовать фосфодиэфирные связи в одноцепочечной или двухцепочечной ДНК или РНК, то есть она не может расщеплять одноцепочечные или двухцепочечные ДНК или РНК.Обычно используется в синтезе второй цепи кДНК.

Это странно.Мы говорим, что обратная транскриптаза обладает активностью РНКазы H, а не то, что обратная транскриптаза содержит РНКазу H, и может оказаться невозможным отделить РНКазу H от обратной транскриптазы, возможно, из-за конформации определенных групп в обратной транскриптазе. Эта активность вызвана обратной транскриптазой.

Следовательно, несмотря на более высокую эффективность обратной транскрипции AMV, его РНКазная активность снижает выход кДНК.Конечно, производители реагентов постоянно оптимизируют свои продукты, чтобы максимально исключить активность РНКазы Н в обратной транскриптазе, чтобы увеличить выход кДНК.
Температура отжига

Вторичная структура РНК при разных температурах
См. рисунок выше, на котором показана вторичная структура РНК при различных температурах, и используйте онлайн-инструмент mFold для определения вторичной структуры целевого фрагмента при определенных условиях температуры и концентрации соли.При 55°С вторичная структура РНК еще очень сложна, обратная транскриптаза не может работать и вторичная структура не может быть полностью разрешена до 65°С, в то время как оптимальная температура AMV и M-MLV значительно ниже этой температуры.
что делать?Вторичная структура представляет собой комплементарное спаривание самой матрицы, что приводит к сильной конкуренции между праймером и обратной транскриптазой и матрицей, что приводит к ряду проблем, таких как низкий E и плохая повторяемость.

что делать?Только по возможности повышайте температуру отжига.

Многие производители реагентов улучшают свою обратную транскриптазу с помощью генной инженерии.Некоторые повышают температуру реакции, например Jifan и Aidelai, а некоторые удаляют активную группу фермента РНКазы H, чтобы улучшить сродство между ферментом и матрицей РНК.Высокая аффинность может конкурентно вытеснять вторичную структуру и плавно считываться, а также значительно повышать эффективность обратной транскрипции.
Ключевой момент: обратная транскрипция более важна для обеспечения постоянства эффективности обратной транскрипции (ферменты должны быть не только эффективными, но и стабильными), а не количество загруженного образца, если это не особенно крупномасштабная флуоресцентная количественная ПЦР, это будет невозможно вообще.Множественные кДНК.
Различные производители также приложили некоторые усилия для достижения согласованности.Например, в настоящее время большинство компаний продают обратную транскрипцию в виде стандартного комплекта, что является хорошим выбором.
Например, наборы Foregene RT Easy Series:

RT Easy I (Мастер-премикс для набора для синтеза первой цепи кДНК)

MIQE (5) – информация о целевом гене

Рисунок выше объясняет
1. Эффективность этого гена при повторных экспериментах обычно можно проверить повторными экспериментами.
2. Генный идентификатор, знаете ли.
3. Длина гена, общая длина целевого гена определенно не проблема.При разработке праймеров убедитесь, что длина ампликона составляет от 80 до 200 пар оснований, чтобы обеспечить лучшую эффективность амплификации.
4. Информация о сравнении Sequence Blast, целевой ген необходимо сравнить в банке генов, чтобы предотвратить неспецифическую амплификацию.
5. Наличие псевдогенов.Псевдоген — это последовательность ДНК, похожая на нормальный ген, но утратившая свою нормальную функцию.Он часто существует в многогенном семействе эукариот.Обычно обозначается ψ.Это нефункциональная копия геномной ДНК в геноме, очень похожая на последовательность кодирующего гена., как правило, не транскрибируются и не имеют четкого физиологического значения.
6. Положение праймеров относительно экзонов и интронов.В первые годы, когда мы решали проблему загрязнения ДНК, мы часто обращали внимание на положение праймеров, экзонов и интронов и обычно рассматривали возможность создания праймеров для интронов, чтобы избежать амплификации ДНК.См. рисунок ниже: черный цвет представляет интроны, различные синие цвета представляют экзоны, розовый цвет представляет собой распространенные праймеры, а ярко-красный цвет представляет собой праймеры, охватывающие интроны.

Схема, никогда не правда
Каким идеальным планом это кажется, но на самом деле в большинстве случаев транс-интронные праймеры не такие волшебные, как предполагалось, и они тоже будут вызывать неспецифическую амплификацию.Таким образом, лучший способ предотвратить загрязнение ДНК — полностью удалить ДНК.
7. Прогнозирование конформации.Снова используя этот пример, используйте онлайн-инструмент mFold для определения вторичной структуры целевого фрагмента при определенной температуре и концентрации соли.

Вторичная структура РНК при разных температурах
Вторичная структура представляет собой комплементарное спаривание самой матрицы, что приведет к сильной конкуренции между спариванием праймера и матрицы, а вероятность связывания праймера меньше, что приведет к ряду проблем, таких как низкий E и плохая повторяемость.С помощью программного прогнозирования, если нет проблем со вторичной структурой, это было бы здорово.Если есть, в нашей последующей статье будет конкретно обсуждаться, как решить эту проблему.

MIQE (6) — олигонуклеотиды для количественной ПЦР

В случае флуоресцентной количественной ПЦР первое, с чем приходится сталкиваться каждый день, — это экстракция РНК, а вторым может быть дизайн праймеров.
Прежде всего, мы по-прежнему проверяем правила оформления праймера по контрольному списку MIQE.Это так просто, что отморозки могут смеяться, а мы можем закончить одним предложением: узнать последовательность и положение праймера-зонда и метод модификации.Для метода очистки праймеров синтез праймеров в настоящее время настолько дешев, что количественная ПЦР достойна методов очистки в ПААГ и выше, а информация об инструменте для синтеза не важна.Многие люди десятилетиями делают праймеры и не знают, что синтезатор ABI3900.
Что касается принципов дизайна букваря, вам не нужно запоминать их наизусть, потому что большинство программ для дизайна букваря или онлайн-инструменты могут решить эти проблемы (рекомендуется онлайн-инструмент primer3.ut.ee/), и 99,999% дизайна букваря не делается вручную. Посмотрите, автор иногда разрабатывает сотни букварей в день, если вы будете читать один за другим, это станет косоглазым.
Просто проверьте следующие моменты после того, как праймеры разработаны:
1. Дизайн праймеров ближе к 3'-концу: в случае использования олиго-dT праймеров для синтеза первой цепи кДНК, учитывая эффективность обратной транскрипции и целостность РНК, разработанные праймеры необходимо конструировать близко к 3'-концу для повышения эффективности амплификации.Используйте картинку, чтобы объяснить следующее (нет никакого способа понять это):

Почему праймеры должны разрабатываться близко к 3'-концу, это не должно быть правдой
2. Значение TM: значение Tm составляет 55-65°C (поскольку экзонуклеазная активность является самой высокой при 60°C), а содержание GC составляет 40%-60%.
3. BLAST: Во избежание неспецифической амплификации генома для дополнительной проверки необходимо использовать Blast.

MIQE(7) — процесс количественной ПЦР

1. набор для количественной ПЦР
Согласно требованиям MIQE, мы должны четко описать в статье полные условия реакции, включая конфигурацию системы реакции ПЦР, какой набор используется, кто производитель, насколько велика система реакции, используется ли метод красителя или метод зонда, настройки программы ПЦР.Водители-ветераны обязательно обнаружат, что при выборе комплекта вышеуказанная информация в основном определена.
В настоящее время изготовление и производство наборов для количественной флуоресцентной ПЦР является очень зрелой технологией.Пока вы выбираете не очень плохих производителей, вероятность проблем невелика, но мы все же хотим поделиться с вами несколькими моментами:
Фермент Taq с горячим стартом:Наиболее важной частью ПЦР является фермент Taq с горячим стартом.Ферменты горячего старта на рынке обычно делятся на два типа: один представляет собой химически модифицированный фермент горячего старта (вы можете представить его как заливку парафином), а другой представляет собой фермент горячего старта для модификации антител (связывание антиген-антитело).Химическая модификация является одним из первых способов запуска ферментов в горячем состоянии.При достижении определенной температуры фермент высвобождает свою активность.Фермент горячего старта, модифицированный антителами, использует биологические методы для блокирования активности фермента.При достижении определенной температуры антитело денатурирует и инактивируется как белок, и в игру вступает активность фермента.

Однако какая от этого польза?Дело в том, что активность высвобождения ферментов, модифицированных антителами, выше, чем у химически модифицированных ферментов, поэтому с точки зрения чувствительности ферменты, модифицированные антителами, имеют небольшое преимущество, так что химически модифицированные ферменты в наборах на рынке практически отсутствуют.Если есть, то технология этого производителя все еще застряла в эпохе тысячелетия.
Концентрация ионов магния:Концентрация ионов магния очень важна в реакции ПЦР.Соответствующая концентрация ионов магния может способствовать высвобождению активности фермента Taq.Если концентрация слишком низкая, активность фермента будет значительно снижена;если концентрация слишком высока, катализируемая ферментом неспецифическая амплификация будет усиливаться.Концентрация ионов магния также будет влиять на отжиг праймеров, температуру плавления матрицы и продуктов ПЦР, тем самым влияя на выход амплифицированных фрагментов.Концентрацию ионов магния обычно контролируют на уровне 25 мМ.Конечно, для хорошего набора необходимо хорошо контролировать концентрацию ионов магния.Некоторые продавцы добавляют в реагент хелатирующий агент ионов магния, что позволяет добиться эффекта автоматической регулировки концентрации ионов магния.
Концентрация флуоресцентного красителя:Флуоресцентный краситель, который мы обычно используем, SYBR Green, в основном генерирует флуоресценцию, связываясь с малой бороздкой двухцепочечной ДНК, потому что связывание красителя с двухцепочечной ДНК неспецифично, то есть до тех пор, пока с ней сочетается двухцепочечная ДНК, может происходить флуоресценция, поэтому димеры праймеров и ДНК-матрицы в системе будут объединяться с ней, образуя фоновый сигнал.
PS: Из-за его светочувствительных свойств продукты на рынке обычно упаковываются в коричневые непрозрачные центрифужные пробирки (как показано на рисунке ниже).Однако это столкнется с проблемой.При отборе проб трудно увидеть, всасывается ли жидкость.В этом отношении Qingke действительно самый удобный (как показано на картинке ниже), а прозрачная туба упакована в непрозрачный жестяной пакет.Затем поместите его в жестяной пакет, учитывая удобство защиты от света и отбора проб.Вы должны выбрать правильный номер продукта.TSE204 — это сверхэкономичное существование, которое заставляет меня хотеть сажать траву.

Концентрация флуоресцентного красителя также очень важна.Если концентрация слишком низкая, кривая амплификации не будет повышаться на более поздней стадии и не будет идеальной;если концентрация слишком высока, это вызовет шумовые помехи.Поскольку количественная флуоресцентная ПЦР в основном зависит от значения CT, если концентрация флуоресцентного красителя не отрегулирована должным образом, нижняя точка лучше, чем верхняя.Конечно, подходящая концентрация красителя является лучшей.

РОКС: Красители ROX используются для коррекции ошибок сигнала флуоресценции от лунки к лунке.Некоторые производители приборов требуют калибровки, а другие нет.Например, использование прибора Thermo Fisher Scientific для амплификации ПЦР в реальном времени обычно требует калибровки, включая 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus и т. д. Это описано в общих инструкциях к набору.
qPCR Mix от Foregene также содержит краситель ROX, который удобен для использования в различных моделях.

Набор для ПЦР в реальном времени-Taqman

Обработка слабой водородной связи: Обработка слабых водородных связей является относительно техническим вопросом.Ничто не читал мануалов многих наборов, но ни в одном из них не упоминалась эта тема.На самом деле, это так важно.Сочетание оснований в основном зависит от прочности водородных связей.Сильные водородные связи представляют собой нормальную амплификацию, а слабые водородные связи приводят к неспецифической амплификации.Если слабые водородные связи нельзя хорошо устранить, то и неспецифической амплификации не избежать.По мнению автора, только несколько компаний заметили эту проблему.Когда вы покупаете комплект, вы можете указать, рассматривали ли вы решение в этом отношении для комплекта, который хотите выбрать.

Объем реакции: чаще используется система на 20-50 мкл, и меньшие объемы могут вызвать ошибки.Вообще говоря, в инструкциях к набору рекомендуется использовать реакционные объемы ПЦР.Не будьте умнее и используйте меньшие объемы для экономии средств.цель.Объем, рекомендованный продавцами, действительно проверен, и, возможно, они не могут решить проблему ошибок, вызванных маленькими объемами.
2. Изготовитель и артикул трубной доски
Всем известен принцип флуоресцентной количественной ПЦР.Сбор флуоресценции в основном осуществляется через крышки пробирок для ПЦР.При выборе расходных материалов для ПЦР обращайте внимание на два момента: хорошее светопропускание и соответствие прибору.Вообще говоря, доски и лампы популярных брендов хороши, но нужно тщательно выбирать в плане адаптации, иначе вы не сможете пользоваться инструментом.

4. Знание высшего уровня

MIQE (8) — валидация КПЦР
Это главный приоритет количественной ПЦР!Здесь так много героев упало в песок.Конечно, также возможно, что вам повезло и изученные вами гены простые, поэтому вы проплыли сквозь ледяную пещеру по ветру.Информация о проверке количественной ПЦР предназначена для проверки надежности данных.Перечислим необходимую проверочную информацию следующим образом:

1. Тест на специфику
Специфичность амплификации целевого гена проверяется путем проверки того, является ли картина электрофореза одной полосой;проверка последовательности;кривая плавления, чтобы увидеть, является ли карта пиков одиночной;верификация ферментативного расщепления и другие методы.
Здесь мы ориентируемся на т.анализ неспецифической амплификации методом кривых плавления.Вообще говоря, когда мы разрабатываем праймеры, размер фрагмента продукта должен быть в диапазоне 80-200 пар оснований, что делает температуру плавления продукта ПЦР 80-85 °C.Следовательно, если есть разные пики, должны быть и другие неспецифические продукты амплификации;если пик появляется при температуре ниже 80°C, его обычно считают димером праймера;если пик появляется при температуре выше 85°C, это обычно считается примесью ДНК или более неспецифической амплификации больших фрагментов.
Примечание. Иногда наблюдается только один пик при 80°C.В настоящее время этой концепции необходимо придерживаться.Вполне вероятно, что все результаты амплификации представляют собой димеры праймеров.

Нормальная кривая плавления (один пик без неспецифической амплификации)

Проблемная кривая плавления (неспецифическое усиление ложных пиков)
【Анализ случая】

Есть основной пик, но димер праймера серьезный
Кривая плавления с одним пиком на рисунке ниже может легко обмануть ваши глаза, думая, что это идеальный эксперимент, но результат совершенно неверен.В это время мы должны смотреть на температуру плавления.Температура пика ниже 80°С, что является полностью праймер-димером.

Нет целевого фрагмента, все димеры праймеров
Здесь мой брат не может остановиться.На картинке ниже фотография, сделанная на мобильный телефон, присланный мне отморозком.Реагенты, которые он использовал, относятся к широко используемым в промышленности маркам.Он сменил одну марку с префиксом T на другую марку с префиксом T.Думаю, вы уже догадались.Подонок закричал мне: «Реагент, использованный на первой картинке, слишком хорош, и пик одиночный.Позже, после использования рекомендованного вами реагента, он становится таким, как на второй картинке, со смешанными пиками.Ты сделал меня несчастным.“
Разделите два графика.На первый взгляд, у одного пик один, у другого двойной пик.Ерунда, единичный пик это конечно нормально.Это правда?
Хуже, чем Dou E, если я поставлю две картинки на картинке ниже, вы сразу поймете.На самом деле нас легко парализует такая картина.После тщательного анализа мы обнаружили, что: пик первой фигуры находится при 75°С, что является полностью димером праймера;пик второй цифры появляется при 75°С и 82°С, по крайней мере, там Продукт появляется.

Фотографии отзывов учеников
Так что фундаментальной проблемой является не проблема реагентов, а проблема дизайна праймера.В то же время это также доказывает, что некоторые крупные бренды не имеют качества железа, а также подтверждает то, что мой брат сказал ранее: это не бренд реагента, который поддерживает вашу статью.Это ваша статья подпирала марку реагентов.Только представьте, если бы отморозок не поменял реактивы, в журнал были бы отправлены неверные данные, и случилась бы трагедия.
2. Значение Ct пустого контроля
Не поясняйте, если контрольная холостой проба имеет значение Ct, разве это не загрязнение?Тем не менее, вам все равно нужно понять, какой пустой элемент управления имеет значение Ct.Если это NTC, это означает наличие чужеродной ДНК, такой как загрязнение реагентом.Если это НЗТ, это означает, что выделенная РНК имеет примеси ДНК.
3. Стандартная кривая
Включая наклон и формулу расчета, эффективность ПЦР можно рассчитать по формуле.Идеальный эксперимент требует, чтобы наклон стандартной кривой приближался к 3,32, а R² приближался к 0,9999.
4. Линейный динамический диапазон
Динамический диапазон реакции линейный.В соответствии с шаблоном, используемым для построения стандартной кривой, динамический диапазон должен включать не менее 5 градиентов концентрации, и обращать внимание на изменение значений Ct при высоких градиентах концентрации и низких градиентах концентрации.
5. Точность обнаружения
Изменения результатов количественной ПЦР, то есть плохая воспроизводимость, то есть низкая точность, вызваны многими факторами, включая температуру, концентрацию и операцию.Точность qPCR обычно становится менее контролируемой по мере уменьшения количества копий.В идеале внутриэкспериментальная вариация, эта техническая вариация должна отличаться от биологической вариации, а биологические повторы могут напрямую учитывать статистические различия в результатах количественной ПЦР между группами или методами лечения.В частности, для диагностических анализов необходимо сообщать о наилучшей точности (повторяемости) между анализами для разных центров и операторов.
6. Эффективность обнаружения и LOD (в мультиплексной количественной ПЦР)
LOD - это самая низкая концентрация из 95% обнаруженных положительных образцов.Другими словами, концентрация LOD, содержащихся в наборе реплик целевого гена, не должна превышать 5% неудачных реакций.При выполнении мультиплексного анализа кПЦР, особенно для одновременного обнаружения точечных мутаций или полиморфизмов, мультиплексная кПЦР должна предоставить доказательства того, что точность нескольких фрагментов-мишеней не снижается в одной и той же пробирке, эффективность множественного обнаружения и обнаружения в одной пробирке и LOD должны быть одинаковыми.На эту проблему следует обратить внимание, особенно когда одновременно амплифицируются гены-мишени с высокой концентрацией и гены-мишени с низкой концентрацией.
Проблемы и решенияВообще говоря, проблемы, часто возникающие при отладке qPCR, сосредоточены на следующих аспектах:
· неспецифическая амплификация
·Сложный выбор концентрации праймера и проблемы с праймерами-димерами
·Температура отжига неточная
·Вторичная структура влияет на эффективность усиления
неспецифическая амплификация
неспецифическая амплификацияслучается, обычно считается, не подходит ли конструкция праймера, но если вы не спешите менять праймеры, то можно сначала попробовать следующие способы (принцип тоже прилагается):
· Увеличьте температуру отжига – постарайтесь сделать слабые водородные связи неподдерживаемыми;
·Сократить время отжига и удлинения – уменьшить вероятность образования слабых водородных связей;
·Уменьшить концентрацию праймеров – снизить вероятность связывания избыточных праймеров и нецелевых областей;
Низкая эффективность усиления
Ситуация, обратная неспецифической амплификации – низкая эффективность амплификации, и меры борьбы с низкой эффективностью амплификации прямо противоположны:
·Увеличить время отжига и удлинения;
·Перейти на трехступенчатую ПЦР и снизить температуру отжига;
· Увеличить концентрацию праймера;
Ps: Многие аспиранты, родившиеся в 90-х годах, не желают изучать, как отлаживать эксперименты, и надеются, что набор может полностью решить проблему (если вы хотите пойти в компанию по производству реагентов, чтобы заняться исследованиями и разработками после окончания учебы), на самом деле производители реагентов также думают так, я надеюсь, что это дура. Его можно использовать, когда вы его получите, поэтому производители реагентов потратили много усилий на решение проблемы неспецифической амплификации, включая введение слабых коэффициентов поглощения водородных связей.Чтобы легко решить проблему, дураки все равно должны прочитать введение компании-реагента, чтобы увидеть, есть ли фактор, поглощающий слабые водородные связи.
Сложный выбор концентрации праймера и проблемы с праймерами-димерами
Способ 1: Вообще говоря, инструкции к набору для количественной ПЦР содержат рекомендуемые системы и рекомендуемые концентрации праймеров.
Способ 2: Отладка путем установки градиента концентрации праймера.Изображение ниже украдено у компании для иллюстрации.На рисунке ниже показаны количественные результаты флуоресценции, полученные с тремя градиентами концентрации праймера (100 нМ, 250 нМ, 500 нМ) и четырьмя градиентами концентрации матрицы (0,1 нг, 1 нг, 10 нг, 100 нг).Значение Ct экспериментальных результатов отображается следующим образом:

Выбор концентрации праймера Объедините каждую концентрацию праймера в строку следующим образом:

Выбор концентрации праймера очевиден, линейная зависимость концентрации праймера 100 нМ и 250 нМ лучше, а линейная зависимость концентрации праймера 500 нМ относительно плохая.В 100 нМ и 250 нМ значение Ct 250 нМ относительно мало, поэтому оптимальная концентрация праймера составляет 250 нМ.Как правило, на кривой плавления можно увидеть тяжелые димеры праймеров.Что делать, если разработанные праймеры не могут избежать праймеров-димеров?
Способ 3: Уменьшите количество грунтовки и увеличьте температуру отжига (объяснять не нужно).
Эмпирическое значение температуры отжига составляет 60°С.Если вы не уверены, как выбрать более подходящую температуру отжига?Ответ такой же, как и выбор концентрации праймера –градиентный тест.Сделайте снимок от компании Bio-rad, чтобы проиллюстрировать проблему.Для амплификации определенного целевого фрагмента задают восемь температурных градиентов, каждый с тремя повторениями, и получают следующую кривую амплификации:

выбор температуры отжига:
·70°C, 69°C — в основном праймеры нельзя комбинировать, поэтому амплификация не происходит.
·67,3°C – В начале наблюдается небольшое усиление, а значение Ct относительно велико.
·64,5°C——Значение Ct уменьшается.
· При 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C и 55,0°C значения Ct в основном оставались стабильными, но конечные значения флуоресценции отличались.
Как выбрать?Принцип: Первый принцип – более высокое значение Ct.Для того же значения Ct выберите более высокую температуру отжига, чтобы избежать димеризации и неспецифической амплификации.Хотя при 55°С наблюдается более высокое значение флуоресценции, в нем могут быть димеры или неспецифическая амплификация.
Но если вы такой же умный, как вы, вы обязательно подумаете: логически говоря, если реакция ПЦР очень специфична, пока концентрация праймера превышает минимальное требование, высокие и низкие точки не должны иметь никакого эффекта, как флуоресцентные красители и dNTP.В самом деле, если температура отжига правильно оптимизирована, влияние концентрации праймера на значение Ct, естественно, будет сведено к минимуму.

Температура отжига оптимально оптимизирована, и влияние концентрации праймера на CT будет сведено к минимуму.
Вторичная структура влияет на эффективность усиления
Давайте возьмем картинку от Bio-rad, чтобы проиллюстрировать проблему.Он также создает температурный градиент для усиления гена со вторичной структурой.

Возникает вторичная структура
Видно, что при уменьшении градиента температуры начинают появляться продукты и значение Ct сдвигается вперед, достигая минимального значения при 60,7°С, а затем по мере уменьшения градиента температуры значение Ct становится больше.Наоборот, при повышении температуры вторичная структура раскрывается и эффективность усиления возрастает.После достижения определенной температуры повышение температуры не может улучшить эффективность усиления.Потому что в настоящее время праймеры не могут быть стабильно объединены.Поэтому,искать температуру с самым низким значением Ct, что является лучшей температурой для усиления шаблона вторичной структуры!Конечно, умные дураки должны знать, что если в этом нет необходимости, то лучше всего сменить праймеры и избегать области вторичной структуры.
5. Уровень приложения
MIQE — анализ данных

Анализ данных в основном проводится с помощью флуоресцентного количественного ПЦР.В предыдущей статье было проделано много работы по анализу данных, например, по пустому контролю, который был объяснен в плане эксперимента.Внутренние эталонные гены, количество повторов и т. д. были уточнены., здесь мы в основном объясняем применение количественной ПЦР.
qPCR широко используется, а экспериментальная проверка и диагностика нуклеиновых кислот являются наиболее часто используемыми сценариями.
абсолютная количественная оценка
Log (начальная концентрация) имеет линейную зависимость от количества циклов.Стандартную кривую можно построить по стандарту с известным начальным числом копий, то есть можно получить линейную зависимость реакции амплификации.По значению Ct образца можно рассчитать концентрацию в образце.Количество шаблонов для включения.

Метод абсолютного количественного расчета
Абсолютное количественное определение должно быть основано на стандартной кривой.Чтобы сделать стандартную кривую, требуется стандарт.Обычно стандарт представляет собой плазмиду, полученную путем клонирования гена-мишени.Почему это плазмида?Потому что кольцевая плазмидная ДНК является наиболее стабильной.Разбавьте стандартный продукт в 5-6 градиентах в соответствии с коэффициентом удвоения (10-кратное разведение) и обратите внимание на однородность при разбавлении.Пусть значение Ct падает между 15-30.

Стандартная подготовка
В то же время тестируемый образец также должен быть соответствующим образом разбавлен (помните о коэффициенте разбавления), а значение Ct также должно находиться в пределах 15-30.Стандартный продукт + испытуемый образец помещаются на машину вместе.После эксперимента строили стандартную кривую со стандартным веществом, и образцы, которые нужно тестировать, помещали на стандартную кривую для расчета концентрации.
Количественное определение HBV вируса гепатита B является типичным абсолютным количественным определением, которое позволяет рассчитать количество копий вируса в 1 мл крови.
Расчет количества копий
Концентрация исследуемого образца (нг/мкл) = OD260 × 50 мкг/мл × коэффициент разбавления
Молекулярная масса образца = количество оснований × 324
Количество копий тестируемого образца (копий/мкл) = концентрация тестируемого образца / молекулярная масса образца × 6 × 1014

Метод расчета количества копий

Выше приведен метод расчета для определения количества.Это математическая задача, которую можно решить после окончания средней школы, а математические задачи обычно решаются с помощью компьютеров.Если вы не понимаете, вы можете прийти пообщаться.
относительная количественная оценка
Относительная количественная оценка в основном используется в научных исследованиях.Сколько вирусов в 1 мл крови, а это ДНК-вирус, это относительно детерминированное событие: количество крови можно определить, а ДНК-вирус относительно стабилен.Однако нам сложно сравнивать количество копий транскрипции определенного гена в листе, потому что трудно определить размер, вес и нежность листа, трудно определить количество выделенной РНК, а также трудно определить эффективность обратной транскрипции, то есть любой шаг может привести к ошибкам в экспериментальных данных и не может быть использован.
Следовательно, относительная количественная оценка должна вводить элемент:внутренний эталонный ген.
Другими словами, относительная количественная оценка на самом деле представляет собой сравнение между целевым геном и внутренним эталонным геном.По сравнению с той же тканью и той же клеткой влияние размера образца, количества экстрагируемой РНК, эффективности обратной транскрипции и эффективности ПЦР относительно невелико.Из-за небольшого размера выборки как внутренние эталонные гены, так и гены-мишени были относительно уменьшены.Вот почему раньше мы подчеркивали единообразие и стабильность.
Внутренние референсные гены обычногены домашнего хозяйства(гены домашнего хозяйства), которые относятся к классу генов, стабильно экспрессирующихся во всех клетках, а их продукты необходимы для поддержания основной жизнедеятельности клеток.
Не путайте это понятие.Гены домашнего хозяйства — это термины биологических функций, а внутренние эталонные гены — экспериментальные технические термины.Гены домашнего хозяйства должны пройти проверку, прежде чем их можно будет выбрать в качестве внутренних эталонных генов.
Например, мы выбрали несколько генов домашнего хозяйства на рисунке ниже, чтобы проверить уровни их экспрессии в различных тканевых клетках, и обнаружили, что уровни экспрессии β-2-микроглобулина сильно отличаются от уровней экспрессии трех других генов, поэтому их нельзя использовать в качестве внутренних эталонных генов.

После понимания корректирующей функции внутреннего эталонного гена выводятся два алгоритма благодаря введению внутреннего эталонного гена.
· метод двойной стандартной кривой
·2 – метод △△Ct (метод сравнения значений CT)
Если вы заинтересованы в изучении видов и функций генов, пожалуйста, откажитесь от исследований алгоритмов и используйте формулы напрямую или напрямую используйте машины;если вы нормальный парень в математике и технике, пожалуйста, не стесняйтесь.
метод двойной стандартной кривой
Количественно определите целевой ген и ген домашнего хозяйства контрольного образца и образца для тестирования с помощью стандартной кривой, а затем рассчитайте относительное значение в соответствии с формулой расчета, которая является относительным уровнем экспрессии.
Преимущества: простой анализ, относительно простая экспериментальная оптимизация.
Недостаток: для каждого гена каждый раунд экспериментов должен строить стандартную кривую.
Применение: один из двух наиболее часто используемых и признанных относительных количественных методов в изучении регуляции экспрессии генов.
Формула выглядит следующим образом:

Примеры следующие:

Рассчитать относительное количество на основе количественного результата
2 – метод △△Ct (метод сравнения значений CT)

Преимущества: Нет необходимости делать стандартную кривую
Недостатки: Предполагается, что эффективность усиления близка к 100%;стандартное отклонение составляет < 5%, и предполагается, что стандартная кривая и эффективность между каждой амплификации непротиворечивы;оптимизация условий эксперимента более сложна.
Применение: один из двух наиболее часто используемых и признанных относительных количественных методов в изучении регуляции экспрессии генов.

Конечно, эффективность амплификации обычно не может быть идеальной 1. Метод коррекции: Если мы знаем, что целевой ген и эталонный ген имеют одинаковую эффективность амплификации, но эффективность амплификации не равна 1, то 2－△△Ct можно скорректировать следующим образом: (1+E )－△△Ct, например, если эффективность амплификации равна 0,95, то формула расчета может быть скорректирована до 1,95. －△△Кт
На этом материалы о флуоресцентной количественной ПЦР подошли к концу.