Колонка забита

После того, как колонка закупорена, выход РНК снижается или даже становится невозможным ее очистку, а полученная масса РНК низка.

Анализ общей причины:

1. Перерывы между образцами не являются полными.

Поломка образца не приводит к полной блокировке КОЛОНКИ ДЛЯ ОЧИСТКИ ДНК, но влияет на выход и качество РНК.Мы рекомендуем быстрое измельчение в достаточном количестве жидкого азота, когда вы ломаете образцы. Попробуйте раздавить клеточную стенку образца, клеточную мембрану и другие ткани.Для растительных образцов полиоловых полисахаридов мы рекомендуем использовать Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

2. При отсасывании супернатанта отделенного образца с помощью колонки для очистки ДНК возможный фрагментированный осадок клеток может попасть в дыхательные пути.

Взятые фрагментированные осадки клеток вызовут колонку RNA-ONLY, которая будет заблокирована при выполнении операции адсорбции РНК (см. шаг 6).Мы рекомендуем вам осторожно отсасывать этот супернатант, чтобы избежать отсасывания клеточного мусора.

3. Начальная сумма образца слишком велика.

Чрезмерное использование образца приведет к неполной фрагментации образца или неполному лизису клеток буфером PSL1, что приведет к блокировке колонки для очистки во время очистки.Набор для выделения общей РНК растений Масса каждого отдельного очищенного рабочего образца составляет 50 мг.Для растительных образцов полиоловых полисахаридов мы рекомендуем вам попробовать Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

4. Температура центрифуги слишком низкая.

Весь процесс выделения и очистки РНК проводят при комнатной температуре (20-25°C), за исключением того, что ткань образца разрушается жидким азотом. Температура некоторых криогенных центрифуг ниже 20℃, что может привести к блокировке колонки для очистки ДНК и/или колонки только для РНК.В этом случае установите температуру центрифуги на 20-25℃, иубедитесь, что лизисная смесь и/или супернатант с добавлением этанола были предварительно нагреты до 37°C.

РНК не экстрагируется или выход РНК низкий

Обычно на эффективность извлечения влияет множество факторов, таких как: содержание РНК в образце, метод работы, объем элюции и т. д.

Анализ распространенных причин, как показано ниже:

1. Во время операции проводили ледяную баню или низкотемпературное (4°C) центрифугирование.

Предложение: работайте при комнатной температуре (15-25°C) в течение всего процесса не применяйте ледяную баню и низкотемпературное центрифугирование.

2. РНК деградировала из-за неправильного хранения образца или длительного хранения образца.

Рекомендация: Свежесобранные образцы следует быстро заморозить в жидком азоте, а затем хранить при температуре -80°C в течение длительного времени, избегать повторного замораживания и оттаивания образцов;или немедленно замочите образцы в растворе стабилизатора РНК RNAlater (образцы животных).

3. Недостаточная фрагментация и лизис образца приводят к закупорке очистной колонки.

Предложение: при измельчении ткани убедитесь, что ткань достаточно измельчена, и быстро перенесите ее в предварительно подготовленный буфер PSL1 (подтвердите, что добавлена ​​правильная пропорция β-ME, см. шаг 1 процедуры).

4.Элюент был добавлен неправильно.

Предложение: убедитесь, что ddH2O, не содержащая РНКазы, капает в середину мембраны очистительной колонки.

5. Неправильный объем абсолютного этанола был добавлен в буфер PSL2 или буфер PRW2.

Рекомендация: Пожалуйста, следуйте инструкциям, добавьте правильный объем абсолютного этанола в буфер PSL2 и буфер PRW2 и хорошо перемешайте перед использованием набора.

6. Несоответствующее количество образца ткани.

Предложение: Используйте 50 мг ткани на 500 мкл буфера PSL1.Использование слишком большого количества ткани уменьшит количество экстрагированной РНК, а также снизится чистота полученной РНК.Мы настоятельно рекомендуем, чтобы начальная доза образца не превышала 50 мг на операцию выделения РНК.

7. Несоответствующий объем элюции или неполная элюция.

Предложение: Объем элюента очистной колонки 50-200 мкл;если эффект элюирования неудовлетворителен, рекомендуется увеличить время при комнатной температуре после добавления предварительно нагретой ddH2O, не содержащей РНКазы, например, 5-10 мин.

8. Колонка очистки имеет остаток этанола после промывки BufferPRW2.

Предложение: если пустая пробирка центрифугируется в течение 1 мин и после промывки в буфере PRW2 все еще остается этанол, можно увеличить время центрифугирования пустой пробирки до 2 мин или поместить очистительную колонку при комнатной температуре на 5 мин для полного удаления остаточного этанола.

9. Комплект использовался неправильно.

Предложение: Для растительных образцов полифенольных полисахаридов использование обычных наборов, таких как набор для выделения общей РНК растений, может не позволить получить идеальные образцы РНК.Мы рекомендуем использовать набор Plant Total RNA IsolationKit Plus, специально разработанный для образцов полифенольных полисахаридов растений.Набор, специально разработанный для выделения РНК из образцов полифенолов и полисахаридов растений.

Низкое значение OD260/OD280

Элюирование РНК ddH2O и использование для показаний спектрофотометра приводит к низким значениям OD260/OD280.Мы рекомендуем использовать 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5 (а не ddH2O, не содержащую РНКазы, для элюирования РНК) для получения относительно правильных значений OD260/OD280, см. «Концентрация РНК и анализы очистки» на стр. 19.

Очищенная РНК деградирует

Качество очищенной РНК зависит от таких факторов, как сохранение образца, загрязнение РНКазой и манипуляции.

Анализ распространенных причин:

1. Образцы тканей не хранились вовремя после сбора.

Рекомендация: Если образцы тканей не используются вовремя после сбора, немедленно поместите их в жидкий азот при низкой температуре или перенесите их в -80°C для длительного хранения после быстрого замораживания в жидком азоте, или немедленно погрузите образцы в раствор стабилизатора РНК RNAlater (образцы животных).Для выделения РНК попробуйте использовать свежесобранные образцы тканей.

2. Многократное замораживание и оттаивание образцов тканей.

Предложение: при хранении образцов тканей лучше всего разрезать их на мелкие кусочки для сохранения и вынимать часть из них при использовании, чтобы избежать деградации РНК, вызванной повторным замораживанием и оттаиванием образцов.

3. РНКаза вводится в операционной или в не надетых одноразовых перчатках, масках и т.п.

Предложение: эксперименты по извлечению РНК лучше всего проводить в отдельных операциях с РНК, при этом лабораторный стол должен быть очищен перед экспериментом, а во время эксперимента следует носить одноразовые перчатки и маски, чтобы в наибольшей степени избежать деградации РНК, вызванной введением РНКазы.

4. Реагент загрязнен РНКазой во время использования.

Предложение: заменить новой серией наборов для экстракции тотальной РНК растений для связанных экспериментов.

5. Центрифужные пробирки и наконечники пипеток, используемые для манипуляций с РНК, загрязнены РНКазой.

Предложение: убедитесь, что центрифужные пробирки, наконечники пипеток, пипетки и т. д., используемые для выделения РНК, не содержат РНКазы.

Инструкции по эксплуатации:

Набор для выделения общей РНК растений плюс инструкция по эксплуатации