Объяснение основных терминов молекулярной биологии
1. кДНК и кзкДНК: кДНК представляет собой двухцепочечную ДНК, синтезируемую обратной транскриптазой из мРНК;кзкДНК представляет собой плазмидную двухцепочечную замкнутую кольцевую ДНК, свободную от хромосомы.
2. Стандартная единица укладки: единица вторичной структуры белка α-спираль и β-лист могут образовывать структурные блоки со специальным геометрическим расположением посредством различных соединительных полипептидов.Этот тип детерминированной складчатости обычно называют супервторичной структурой.Этими складчатыми типами и даже их комбинированными типами можно описать почти все третичные структуры, поэтому их еще называют стандартными складчатыми единицами.
3. CAP: белок рецептора циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) CRP (белок рецептора цАМФ), комплекс, образующийся после комбинации цАМФ и CRP, называется активирующим белком CAP (активированный белок цАМФ).
4. Палиндромная последовательность: обратная комплементарная последовательность сегмента фрагмента ДНК, часто сайт рестрикции.
5. микроРНК: комплементарная интерферирующая РНК или антисмысловая РНК, которая комплементарна последовательности мРНК и может ингибировать трансляцию мРНК.
6. Рибозим: РНК с каталитической активностью, которая играет автокаталитическую роль в процессе сплайсинга РНК.
7. Мотив: в пространственной структуре белковых молекул имеются локальные области со сходной трехмерной формой и топологией.
8. Сигнальный пептид: пептид с 15-36 аминокислотными остатками на N-конце во время синтеза белка, который направляет трансмембрану белка.
9. Аттенюатор: нуклеотидная последовательность между операторной областью и структурным геном, которая терминирует транскрипцию.
10. Волшебное пятно: Когда бактерия растет и сталкивается с полным отсутствием аминокислот, бактерия вырабатывает экстренную реакцию, чтобы остановить экспрессию всех генов.Сигналами, вызывающими эту экстренную реакцию, являются тетрафосфат гуанозина (ppGpp) и пентафосфат гуанозина (pppGpp).Роль PpGpp и pppGpp заключается не в одном или нескольких оперонах, а в большом их количестве, поэтому их называют суперрегуляторами или волшебными пятнами.
11. Промоторный элемент выше по течению: относится к последовательности ДНК, которая играет регулирующую роль в активности промотора, такой как ТАТА в области -10, TGACA в области -35, энхансеры и аттенюаторы.
12. ДНК-зонд: меченый сегмент ДНК с известной последовательностью, который широко используется для обнаружения неизвестных последовательностей и скрининга генов-мишеней.
13. Последовательность SD: это связывающая последовательность рибосомы и мРНК, которая регулирует трансляцию.
14. Моноклональное антитело: антитело, которое действует только против одной антигенной детерминанты.
15. Космида: это искусственно сконструированный вектор экзогенной ДНК, который сохраняет области COS на обоих концах фага и соединен с плазмидой.
16. Скрининг сине-белых пятен: ген LacZ (кодирующий β-галактозидазу), фермент может разлагать хромогенный субстрат X-gal (5-бром-4-хлор-3-индол-β-D-галактозид) с образованием синего цвета, что делает штамм синим.Когда экзогенная ДНК вставлена, ген LacZ не может быть экспрессирован, и штамм имеет белый цвет для скрининга рекомбинантных бактерий.Это называется сине-белым экранированием.
17. Цис-действующий элемент: определенная последовательность оснований в ДНК, которая регулирует экспрессию генов.
18. Фермент Кленова: большой фрагмент ДНК-полимеразы I, за исключением того, что 5'3'-экзонуклеазная активность удалена из холофермента ДНК-полимеразы I.
19. Заякоренная ПЦР: используется для амплификации интересующей ДНК с известной последовательностью на одном конце.К одному концу неизвестной последовательности добавляли хвост поли-dG, а затем поли-dC и известную последовательность использовали в качестве праймеров для ПЦР-амплификации.
20. Слитый белок: ген эукариотического белка связан с экзогенным геном, и одновременно экспрессируется белок, состоящий из трансляции белка исходного гена и экзогенного белка.
Другие термины молекулярной биологии
1. Физическая карта ДНК представляет собой порядок, в котором расположены (расщепленные эндонуклеазами рестрикции) фрагменты молекулы ДНК.
2. Расщепление РНКазы делится на два типа (автокатализ) и (гетерокатализ).
3. У прокариот есть три фактора инициации: (IF-1), (IF-2) и (IF-3).
4. Трансмембранные белки требуют наведения (сигнальные пептиды), а роль белковых шаперонов состоит в том, чтобы (помогает сворачивать пептидную цепь в нативную конформацию белка).
5. Элементы в промоторах обычно можно разделить на два типа: (основные промоторные элементы) и (вышестоящие промоторные элементы).
6. Содержание исследований молекулярной биологии в основном включает три части: (структурная молекулярная биология), (экспрессия и регуляция генов) и (технология рекомбинации ДНК).
7. Двумя ключевыми экспериментами, демонстрирующими, что ДНК является генетическим материалом, являются (заражение мышей пневмококком) и (заражение фагом T2 Escherichia coli).потенциал).
8. Между гяРНК и мРНК есть два основных отличия: (яРНК подвергается сплайсингу в процессе превращения в мРНК), (5'-конец мРНК дополнен кэпом m7pGppp, а на 3'-конце кислотного (полиА)-хвоста мРНК имеется дополнительное полиаденилирование).
9. Преимущества многосубъединичной формы белка: (субъединица является экономичным методом использования ДНК), (может уменьшить влияние случайных ошибок в синтезе белка на активность белка), (активность может быть очень эффективно и быстро открыта и закрыта).
10. Основное содержание механизма укладки белка первая теория нуклеации включает (нуклеация), (структурное обогащение), (окончательная перестройка).
11. Галактоза оказывает двойное действие на бактерии;с одной стороны (его можно использовать как источник углерода для роста клеток);с другой стороны (он также является компонентом клеточной стенки).Следовательно, для постоянного синтеза на фоновом уровне необходим цАМФ-CRP-независимый промотор S2;в то же время для регуляции высокоуровневого синтеза необходим цАМФ-CRP-зависимый промотор S1.Транскрипция начинается с (S2) с G и с (S1) без G.
12. Технология рекомбинантной ДНК также известна как (генное клонирование) или (молекулярное клонирование).Конечная цель состоит в том, чтобы (перенести генетическую информацию ДНК одного организма в другой организм).Типичный эксперимент по рекомбинации ДНК обычно включает следующие этапы: (1) Извлечение гена-мишени (или экзогенного гена) из организма-донора и ферментативное соединение его с другой молекулой ДНК (вектором клонирования) с образованием новой молекулы рекомбинантной ДНК.② Молекула рекомбинантной ДНК переносится в клетку-реципиент и реплицируется в клетке-реципиенте.Этот процесс называется преобразованием.③ Скрининг и идентификация тех клеток-реципиентов, которые поглотили рекомбинантную ДНК.④Культивируйте клетки, содержащие рекомбинантную ДНК в больших количествах, чтобы определить, экспрессируется ли ген внешней помощи.
13. Существует два типа репликации плазмид: те, которые строго контролируются синтезом белка клетки-хозяина, называются (плотные плазмиды), а те, которые строго не контролируются синтезом белка клетки-хозяина, называются (расслабленные плазмиды).
14. Реакционная система ПЦР должна соответствовать следующим условиям: a.ДНК-праймеры (около 20 оснований) с комплементарными последовательностями на каждом конце двух нитей целевого гена, которые необходимо разделить.б.Ферменты с термостабильностью, такие как: полимераза TagDNA.c, dNTPd, интересующая последовательность ДНК в качестве матрицы
15. Основной реакционный процесс ПЦР включает три стадии: (денатурация), (отжиг) и (удлинение).
16. Основной процесс трансгенных животных обычно включает: ①Введение клонированного чужеродного гена в ядро оплодотворенной яйцеклетки или эмбриональной стволовой клетки;② Трансплантация инокулированной оплодотворенной яйцеклетки или эмбриональной стволовой клетки в женскую матку;③Полное эмбриональное развитие и рост Для потомства с чужеродными генами;④ Используйте этих животных, которые могут продуцировать чужеродные белки, в качестве племенного поголовья для выведения новых гомозиготных линий.
17. Линии гибридомных клеток получают путем гибридизации клеток (селезенки В) с клетками (миеломы), и, поскольку (клетки селезенки) могут использовать гипоксантин, а (клетки кости) обеспечивают функции клеточного деления, их можно выращивать в среде HAT.расти.
18. По мере углубления исследований выделяют первое поколение антител (поликлональные антитела), второе поколение (моноклональные антитела) и третье поколение (генно-инженерные антитела).
19. В настоящее время генная инженерия вирусов насекомых сосредоточена в основном на бакуловирусах, что проявляется во внедрении (экзогенного токсинного гена);(гены, нарушающие нормальный жизненный цикл насекомых);(модификация вирусных генов).
20. Трансактивные белковые факторы, соответствующие общим элементам ТАТА, GC и СААТ в промоторе РНК-полимеразы II млекопитающих, представляют собой (TFIID), (SP-1) и (CTF/NF1) соответственно.
двадцать один.Основными факторами транскрипции РНК-полимеразы Ⅱ являются TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, а их последовательность связывания: (D, A, B, E).При этом функция TFII-D (привязка к ТАТА-боксу).
двадцать два.Большинство факторов транскрипции, которые связываются с ДНК, работают в форме димеров.Функциональные домены факторов транскрипции, которые связываются с ДНК, обычно следующие (спираль-поворот-спираль), (мотив цинкового пальца), (основной-лейцин) мотив-молния).
двадцать три.Существует три типа режимов расщепления рестрикционными эндонуклеазами: (разрезать на 5'-стороне оси симметрии для образования 5'-липких концов), (разрезать на 3'-стороне оси симметрии для образования 3'-липких концов (разрезать на оси симметрии для образования плоских сегментов)).
двадцать четыре.Плазмидная ДНК имеет три различные конфигурации: (SC-конфигурация), (oc-конфигурация), (L-конфигурация).Первым в электрофорезе является (конфигурация SC).
25. Экзогенные системы экспрессии генов, в основном (Escherichia coli), (дрожжи), (насекомые) и (таблица клеток млекопитающих).
26. Обычно используемые методы для трансгенных животных: (метод ретровирусной инфекции), (метод микроинъекции ДНК), (метод эмбриональных стволовых клеток).
Применение Молекулярная биология
1. Назовите функции более 5 РНК?
Транспортная РНК тРНК Транспортная аминокислота Рибосома РНК рРНК Рибосома представляет собой информационную РНК мРНК Матрица синтеза белка Гетерогенная ядерная РНК гяРНК Предшественник зрелой мРНК малая ядерная РНК мяРНК Участвует в сплайсинге гяРНК Малая цитоплазматическая РНК белок скРНК/7SL-РНК Плазменный ретикулум локализуется и синтезируется компонентами тела распознавания сигнала Антисмысловая РНК анРНК/микроРНК Регулирует экспрессию генов Рибозим РНК Энзи матически активная РНК
2. В чем основное отличие прокариотических и эукариотических промоторов?
Прокариотический TTGACA --- TATAAT ------ Сайт инициации-35 -10 Эукариотический энхансер --- GC --- CAAT---- TATAA-5mGpp- Сайт инициации-110 -70 -25
3. Каковы основные аспекты искусственного конструирования природных плазмид?
Природные плазмиды часто имеют дефекты, поэтому они не подходят для использования в качестве носителей для генной инженерии и должны быть модифицированы и сконструированы: а.Добавьте подходящие маркерные гены селекции, например, два или более, которые легко использовать для селекции, обычно это гены антибиотиков.б.Увеличьте или уменьшите количество подходящих участков разрезания фермента для облегчения рекомбинации.в.Сократите длину, отрежьте ненужные фрагменты, улучшите эффективность импорта и увеличьте грузоподъемность.д.Измените репликон с плотного на свободный, с меньшего количества копий на большее количество копий.е.Добавьте специальные генетические элементы в соответствии с особыми требованиями генной инженерии.
4. Приведите пример метода дифференциального скрининга тканеспецифичной кДНК?
Готовят две клеточные популяции, целевой ген экспрессируется или экспрессируется в высокой степени в одной из клеток, а целевой ген не экспрессируется или экспрессируется в низкой степени в другой клетке, а затем путем гибридизации и сравнения находят целевой ген.Например, при возникновении и развитии опухолей опухолевые клетки будут представлять мРНК с уровнями экспрессии, отличными от нормальных клеток.Следовательно, гены, связанные с опухолью, могут быть отсеяны с помощью дифференциальной гибридизации.Метод индукции также можно использовать для скрининга генов, экспрессия которых индуцируется.
5. Генерация и скрининг клеточных линий гибридомы?
В-клетки селезенки + клетки миеломы добавляют полиэтиленгликоль (ПЭГ) для стимулирования слияния клеток, а слитые клетки В-миеломы селезенки, выращенные в среде HAT (содержащей гипоксантин, аминоптерин, Т), продолжают расширяться и питаться.Слияние клеток содержит: клетки слияния селезенки: неспособны к росту, клетки селезенки нельзя культивировать in vitro.Клетки слияния костей: не могут использовать гипоксантин, но могут синтезировать пурин по второму пути, используя фолатредуктазу.Аминоптерин ингибирует фолатредуктазу и поэтому не может расти.Клетки слияния кости и селезенки: могут расти в HAT, клетки селезенки могут использовать гипоксантин, а костные клетки обеспечивают функцию деления клеток.
6. Каковы принцип и метод определения первичной структуры ДНК методом дидезоксиконцевой терминации (метод Сэнгера)?
Принцип заключается в использовании терминатора нуклеотидной цепи — 2,3,-дидезоксинуклеотида для прекращения удлинения ДНК.Поскольку в нем отсутствует 3-ОН, необходимый для образования 3/5/фосфодиэфирных связей, однажды включенный в цепь ДНК, цепь ДНК не может быть расширена дальше.В соответствии с принципом спаривания оснований, всякий раз, когда ДНК-полимеразе требуется dNMP для участия в нормально вытянутой цепи ДНК, есть две возможности: одна - участвовать в ddNTP, что приводит к прекращению удлинения цепи дезоксинуклеотидов;другой - участвовать в dNTP, так что цепь ДНК может продолжать расширяться до тех пор, пока не будет включен следующий ddNTP.По этому методу можно получить группу фрагментов ДНК разной длины, оканчивающихся на ddNTP.Метод заключается в разделении на четыре группы соответственно ddAMP, ddGMP, ddCMP и ddTMP.После реакции электрофорез в полиакриламидном геле может считывать последовательность ДНК в соответствии с полосами плавания.
7. Каков положительный регулирующий эффект белка-активатора (CAP) на транскрипцию?
Циклический аденилатный (цАМФ) рецепторный белок СРБ (цАМФ-рецепторный белок), комплекс, образованный комбинацией цАМФ и СРБ, называется САР (цАМФ-активированный белок).Когда E. coli выращивают в среде, в которой отсутствует глюкоза, увеличивается синтез CAP, а CAP выполняет функцию активации промоторов, таких как лактоза (Lac).У некоторых CRP-зависимых промоторов отсутствует типичная особенность последовательности области -35 (TTGACA), которая есть у обычных промоторов.Поэтому РНК-полимеразе трудно с ним связываться.Наличие CAP (функция): может значительно улучшить константу связывания фермента и промотора.В основном он показывает следующие два аспекта: ① CAP помогает молекуле фермента правильно ориентироваться, изменяя конформацию промотора и взаимодействуя с ферментом, чтобы объединиться с областью -10 и играть роль замены функции области -35.②CAP также может ингибировать связывание РНК-полимеразы с другими участками ДНК, тем самым увеличивая вероятность связывания с ее специфическим промотором.
8. Какие этапы обычно входят в типичный эксперимент по рекомбинации ДНК?
а.Извлеките целевой ген (или экзогенный ген) из организма-донора и ферментативно соедините его с другой молекулой ДНК (вектором клонирования), чтобы сформировать новую молекулу рекомбинантной ДНК.б.Перенесите молекулу рекомбинантной ДНК в клетку-реципиент, реплицируйте и сохраните ее в клетке-реципиенте.Этот процесс называется преобразованием.в.Скрининг и идентификация тех клеток-реципиентов, которые поглотили рекомбинантную ДНК.д.Массовая культура клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, для определения экспрессии гена внешней помощи.
9. Создание генной библиотеки Приведены три метода скрининга рекомбинантов и кратко описан процесс.
Скрининг устойчивости к антибиотикам, инсерционная инактивация устойчивости, скрининг сине-белых пятен или ПЦР-скрининг, дифференциальный скрининг, ДНК-зонд Большинство клонирующих векторов несут гены устойчивости к антибиотикам (антиампициллину, тетрациклину).При переносе плазмиды в Escherichia coli бактерии приобретают резистентность, а без переноса резистентности не будет.Но он не может различить, была ли она реорганизована или нет.В векторе, содержащем два гена резистентности, если фрагмент чужеродной ДНК вставлен в один из генов и вызывает инактивацию гена, для скрининга положительных рекомбинантов можно использовать два контрольных планшета, содержащих разные лекарственные средства.Например, плазмида pUC содержит ген LacZ (кодирующий β-галактозидазу), который может разлагать хромогенный субстрат X-gal (5-бром-4-хлор-3-индол-β-D-галактозид) с образованием синего, таким образом окрашивая штамм в синий цвет.Когда чужеродная ДНК вставлена, ген LacZ не может быть экспрессирован, и штамм имеет белый цвет, что позволяет проводить скрининг рекомбинантных бактерий.
10. Объясните основной процесс получения трансгенных животных с помощью эмбриональных стволовых клеток?
Эмбриональные стволовые клетки (ЭС) представляют собой эмбриональные клетки во время эмбрионального развития, которые можно искусственно культивировать и размножать, и они имеют функцию дифференцировки в другие типы клеток.Культура клеток ES: внутреннюю клеточную массу бластоцисты выделяют и культивируют.Когда ES культивируют в слое без фидера, он будет дифференцироваться в различные функциональные клетки, такие как мышечные клетки и N-клетки.При культивировании в среде, содержащей фибробласты, ЭС будут поддерживать функцию дифференцировки.ES можно генетически манипулировать, а его функцию дифференциации можно интегрировать, не влияя на ее функцию дифференциации, что решает проблему случайной интеграции.Вводить экзогенные гены в эмбриональные стволовые клетки, затем имплантировать в матку беременных самок мышей, развивать в детенышей и скрещивать для получения гомозиготных мышей.
