Мы были опытным производителем.Завоевание большинства важнейших сертификатов на своем рынке для больших скидок China High Sensitivity One-Step Probe Rt-QпкрКомплект V2, Качество - это жизнь фабрики, Ориентация на спрос клиентов - источник выживания и развития компании, Мы придерживаемся честности и добросовестного отношения к работе, с нетерпением ждем вашего приезда!
Мы были опытным производителем.Завоевание большинства в важнейших сертификатах на своем рынке дляКитайская ДНК-полимераза Taq, Qпкр, Наша компания обещает: разумные цены, короткое время производства и удовлетворительное послепродажное обслуживание, мы также приглашаем вас посетить наш завод в любое время.Желаю теперь у нас есть приятный и долгосрочный бизнес вместе!!!

Описания

В этом наборе используется уникальная буферная система для лизиса, которая может быстро высвобождать РНК из культивируемых образцов клеток для реакций RT-qPCR, тем самым устраняя трудоемкий и трудоемкий процесс очистки РНК.Матрицу РНК можно получить всего за 7 минут.Реагенты 5×Direct RT Mix и 2×Direct qPCR Mix-SYBR, входящие в комплект, позволяют быстро и эффективно получать количественные результаты ПЦР в реальном времени.

5×Direct RT Mix и 2×Direct qPCR Mix-SYBR обладают сильной устойчивостью к ингибиторам, и лизат образцов можно использовать в качестве матрицы для RT-qPCR напрямую.Этот набор содержит уникальную высокоаффинную обратную транскриптазу РНК Foregene и ДНК-полимеразу Hot D-Taq, dNTPs, MgCl.₂, реакционный буфер, оптимизатор ПЦР и стабилизатор.

Технические характеристики

200×20 мкл Rxns, 1000×20 мкл Rxns

Компоненты комплекта

Особенности и преимущества

■ Простота и эффективность: с технологией Cell Direct RT образцы РНК можно получить всего за 7 минут.

■ Потребность в образцах невелика, можно протестировать всего 10 ячеек.

■ Высокая производительность: он может быстро обнаруживать РНК в клетках, культивируемых в 384-, 96-, 24-, 12- и 6-луночных планшетах.

■ DNA Eraser может быстро удалить высвободившиеся геномы, что значительно снизит влияние на результаты последующих экспериментов.

■ Оптимизированная система RT и qPCR делает двухэтапную обратную транскрипцию RT-PCR более эффективной, а PCR более специфичной и более устойчивой к ингибиторам реакции RT-qPCR.

Применение комплекта

Область применения: культивируемые клетки.

- РНК, высвобождаемая при лизисе образца: применимо только к шаблону RT-qPCR этого набора.

- Набор можно использовать для следующих целей: анализ экспрессии генов, проверка эффекта сайленсинга генов, опосредованного siRNA, скрининг лекарств и т. д.

Диаграмма

Хранение и срок годности

Часть I этого комплекта следует хранить при температуре 4 ℃;Часть II следует хранить при температуре -20 ℃.

Foregene Protease Plus II следует хранить при температуре 4 ℃, не замораживать при -20 ℃.

Реагент 2×Direct qPCR Mix-SYBR следует хранить при температуре -20 ℃ в темноте;при частом использовании его также можно хранить при температуре 4 ℃ для кратковременного хранения (израсходовать в течение 10 дней). Мы являемся опытным производителем.Завоевав большинство важнейших сертификатов на своем рынке для больших скидок, Китайский высокочувствительный одношаговый зонд Rt-Qpcr Kit V2, качество - это жизнь завода, ориентация на спрос клиентов - источник выживания и развития компании, мы придерживаемся честности и добросовестного отношения к работе, с нетерпением ждем вашего приезда!
Большие скидкиКитайская ДНК-полимераза Taq, Qpcr, Наша компания обещает: разумные цены, короткое время производства и удовлетворительное послепродажное обслуживание, мы также приглашаем вас посетить наш завод в любое время.Желаю теперь у нас есть приятный и долгосрочный бизнес вместе!!!

QuickEасыTM Cell Direct RT-qПЦР Kit -Такмan

Кат. № DRT-01021/01022

Для прямой RT-qPCR клеток с использованием ≤ 1000 000 клеток

Внедрение продукции

В этом продукте используется уникальная буферная система для лизиса, позволяющая быстро высвобождать РНК из культивируемых клеточных образцов для реакций RT-qPCR, исключая трудоемкий и трудоемкий процесс очистки РНК, и всего 7 минут для получения необходимой матрицы РНК с помощью набора 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman, входящего в комплект, который позволяет быстро и эффективно получать количественные результаты ПЦР в реальном времени.

5× Direct RT Mix и 2× Direct qPCR Mix-Taqman обладают высокой устойчивостью к ингибиторам и могут выполнять эффективную обратную и специфическую амплификацию с использованием лизата измеряемого образца в качестве матрицы.Реагент содержит обратную транскриптазу Foregene, ДНК-полимеразу Hot D-Taq, dNTP, MgCl.₂, реакционный буфер, оптимизатор ПЦР и стабилизатор, который можно использовать с лизисным буфером для быстрого и простого обнаружения образцов, и который обладает характеристиками высокой чувствительности, специфичности и стабильности.

Особенности продукта

Простая и эффективная технология Cell Direct RT, позволяющая получить образцы РНК всего за 7 минут.

Требования к образцам невелики, и для экспериментов можно использовать не менее 10 культивируемых клеток.

Высокая производительность для быстрого получения РНК культивируемых клеток, таких как 384-, 96-, 24-, 12- и 6-луночные планшеты.

DNA Eraser способен быстро удалять высвободившиеся геномы, что значительно снижает влияние на результаты последующих экспериментов.

Оптимизированные системы RT и qPCR позволяют проводить двухэтапную RT-PCR с более эффективной обратной транскрипцией, специфичностью и более сильной устойчивостью к ингибиторам реакции RT-qPCR.

Применение комплекта

Область применения: Культивируемые клетки.

РНК, интерпретируемая лизисом образца: используется только в качестве двухэтапной матрицы RT-qPCR.

Наборы можно использовать для следующих целей: анализ регуляторной экспрессии генов, тестирование аллелей, скрининг лекарств и т. д.

Ограничения набора

Амплифицированные фрагменты ≤ 300 п.н.

Наборы используются для свежей культуры клеток.

Контроль качества продукции

Согласно Общей системе управления качеством FOREGENE, каждая партия наборов серии Cell Direct RT-qPCR тщательно тестируется несколько раз, чтобы гарантировать надежность и стабильность качества каждой партии наборов.

Комплектация

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman можно приобрести отдельно, подробная информация представлена ​​в Приложении 1 (СТР. 13).

Условия хранения

1. Условия доставки

Весь процесс транспортировки коробки со льдом при низкой температуре, чтобы гарантировать, что комплект находится в состоянии <4 ° C.

2. Условия хранения

Хранить часть I при 4°C, а часть II при -20°C.

Foregene Protease Plus II следует хранить при температуре 4°C, а не замораживать при -20°C.

Реагент 2× Direct qPCR Mix-Taqman хранится при температуре -20°C или при 4°C для краткосрочного использования при частом использовании (в течение 10 дней).

Информация о компонентах комплекта

Буфер CL: обеспечивает среду, необходимую для реакций лизиса клеток.

Буфер ST: прекращает активное вещество в лизате, чтобы избежать влияния на последующую RT.

DNA Eraser: средство для удаления ДНК, влияние удаления генома на последующие эксперименты.

5 × Direct RT Mix: содержит высокоаффинную РНК Foregene Reverse Transcriptase, ингибитор РНКазы, dNTP, стабилизаторы, энхансеры, оптимизаторы и праймеры для обратной транскрипции для оптимального выравнивания (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Праймер).

Foregene Protease Plus II: в контексте буфера для лизиса клетки лизируются с высвобождением нуклеиновых кислот.

2 × Прямой кПЦР Mix-Taqman: этот реагент содержит ДНК-полимеразу Hot D-Taq, dNTP, MgCl₂, реакционный буфер, оптимизатор ПЦР и стабилизатор.

20× Эталонный краситель ROX: обычно используется в приборах для амплификации ПЦР в реальном времени от ABI, Stratagene и других компаний, он используется для корректировки разницы между пробирками для ПЦР и пробирками, вызванной ошибками дозирования ПЦР.Концентрация эталонного красителя 20× ROX, необходимая для разных инструментов, различна, и пользователь может добавить ее в соответствии с рекомендуемой концентрацией прибора.

ddH без РНКазы₂O: Стерилизованная сверхчистая вода без РНКазы для двухэтапных реакций RT-qPCR.

Меры предосторожности:(Обязательно прочитайте меры предосторожности перед использованием комплекта)

Обратите внимание на метод работы эксперимента, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами.

Обратите внимание на чистоту экспериментальной среды и посуды, чтобы избежать загрязнения РНКазой и деградации РНК.

Берите свежие или хорошо сохранившиеся образцы клеток и никогда не используйте повторно образцы клеток, подвергнутые замораживанию-оттаиванию.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman следует избегать повторного замораживания-оттаивания, иначе это повлияет на обратную транскрипцию и эффективность ПЦР.

Препапайкидооперация

Перед использованием этого набора обязательно внимательно прочитайте инструкцию.Набор Cell Direct RT-qPCR прост, удобен и быстр в использовании, а инструкции содержат полную информацию обо всем наборе и о том, как правильно его использовать.Пожалуйста, подготовьте необходимые экспериментальные материалы и оборудование перед использованием.

Экспериментальные материалы и оборудование

◆ Культура клеток.

◆ 1,5 мл или 2 мл, центрифужная пробирка без РНКазы/ДНКазы, наконечник без РНКазы/ДНКазы, стерильная пробирка для количественного ПЦР на 0,2 мл.

◆ аппарат для количественной ПЦР, пипетка, настольная центрифуга (≥13 400×г) (в зависимости от потребностей эксперимента) и т. д.

Безопасность

◆ Этот продукт предназначен только для научных исследований, пожалуйста, не используйте его в фармацевтических, клинических, пищевых и косметических целях.

◆ При использовании химикатов надевайте соответствующую лабораторную одежду, перчатки, защитные очки и т. д.

Операциягиды

Системы клеточного лизиса, системы RT и пакеты добавок с реакционным раствором для количественной ПЦР можно приобрести отдельно, подробная информация приведена в Приложении 1 (СТР. 13).

Руководство по эксплуатации

A: Высвобождение образца РНК

1. Клетки предварительно обрабатывали: планшет для культивирования клеток промывали холодным PBS, затем лизировали клетки (10–10⁶), 10⁶ чем количество клеток, рекомендуется Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) или Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) для выделения и очистки РНК.

1.1.Адгезивные клетки (например, 24-луночный планшет)

1.1.1.Определить количество клеток в каждой лунке, определить, что количество клеток равно 1×10⁵, и используйте пипетку для удаления питательной среды из чашки для культивирования.

1.1.2.Добавьте 200 мкл предварительно охлажденного 1 × PBS в каждую лунку.Не пипетируйте повторно и удалите PBS из лунок.Наклоните пластину и удалите как можно больше PBS.Перейдите к шагу 2.

1.1.3.В чашку для культивирования клеток с другим номером или номером ссылки в таблице 1-1 в чашку для культивирования клеток добавляли предварительно охлажденный 1 × PBS для промывания клеток.

Таблица 1-1: Дозировка PBS для разного количества клеток

Примечание：Для обеспечения прочного прилегания клеток，предотвращение потери большого количества клеток при стирке.

1.2.Суспензионные клетки или прилипшие клетки, культивируемые в непористых чашках

1.2.1.Адгезивные клетки, культивируемые в немноголуночных планшетах (суспензионные клетки начинаются со следующего шага 1.2.2), собирают и разделяют клетки в соответствии с обычным методом сбора клеток и помещают их в культуральный планшет или центрифужную пробирку;если используется трипсинизация, требуется центрифугирование для сбора клеток и удаления остаточного трипсина, добавление ресуспендированных клеток PBS в отдельные клетки для диспергирования клеток.

1.2.2.После подсчета количества клеток аликвоты клеток 1×10⁵ один центрифугировать пробирки, собрать клетки путем центрифугирования при 1000 × g в течение 10 мин.

1.2.3.Добавьте 200 мкл PBS в центрифужную пробирку, не пипетируйте повторно и сразу аспирируйте PBS.перейти к шагу 2. (Если трудно осадить и клетки снова ресуспендировали, можно провести центрифугирование при 1000×g через 10 минут после удаления супернатанта, осадок клеток перейти к шагу 2)

2. Лизис клеток: Удалите буфер CL, его температура уравновешивается комнатной температурой, DNA Eraser и Foregene Protease Plus II, в соответствии со следующей таблицей 1-2, подготовленной системой лизиса: (Лизирующий раствор готов к использованию).

Таблица 1-2: расщепление система подготовки (Примечание: при подготовке на льду)

3. (Например, 24-луночный планшет) Внесите по 200 мкл мастер-микса для лизиса клеток в каждую лунку, несколько раз продуйте 5–10 раз, инкубируйте при комнатной температуре (20–25 ℃) в течение 5 мин.

Примечание：Во избежание образования пузырьков, пожалуйста, при пипетировании шкала пипетки была отрегулирована на 200 мкл или меньше.Клетки могут казаться мутными после лизиса, что является нормальным явлением.

4. (24-луночный планшет в качестве примера) добавляют в жидкость 20 мкл буфера ST (различные системы лизиса добавляют буфер ST в количестве, указанном в таблице 1-3), повторяют пипетирование 5-10 раз, при комнатной температуре (20-25 ℃) инкубируют в течение 2 мин.

Примечание：Наконечник пипетки расположен ниже поверхности, что обеспечивает добавление лизата.，во избежание образования пузырьков, пожалуйста, при пипетировании шкала пипетки была отрегулирована на 200 мкл или меньше.

Таблица 1-3：Добавить буфер ST

5. Лизат используется для последующих экспериментов RT-qPCR.Если последующие эксперименты не могут быть выполнены вовремя, держите его на льду не более 2 часов и храните при температуре -20 ℃ или -80 ℃ (не более трех месяцев).

B: Подготовка системы RT

1. Возьмите 5 × Direct RT Mix и поместите их на баню со льдом, дайте им растаять естественным образом и осторожно перемешайте для последующего использования;возьмите ddH2O без РНКазы, растопите ее и поместите на баню со льдом для последующего использования.Подготовьте реакционную систему на льду в соответствии с таблицей 2-1 ниже.

Таблица 2-1: Подготовка реакционной системы RT

2.После завершения составления системы осторожно перемешивают и кратковременно центрифугируют в следующих условиях реакции в таблице 2-2 RT реакция.

Таблица 2-2: Настройка условий реакции ВУ

3. После завершения реакции продукт реакции помещали непосредственно на лед для количественной ПЦР, пожалуйста, поставьте долгосрочное хранение -20 ℃ или -80 ℃.

Примечание. Из-за использования неочищенной матрицы в продукте обратной транскрипции может появиться белый осадок.Это нормальное явление.Сразу центрифугировать супернатант для последующих экспериментов.

Полученный реакционный раствор RT добавляют к реакционным системам ПЦР в реальном времени следующего этапа, рекомендуется добавлять количества в диапазоне от 10 до 30% от реакционной системы.

C: Подготовка реакционной системы для количественной ПЦР

1. Соответствующее количество B, приготовленное на стадии кДНК-матрицы в соответствии со следующей таблицей 3-1, для приготовления реакционной системы.

Примечание. Количество шаблона кДНК составляет 10-30% от системы количественной ПЦР.Например, в систему qPCR объемом 20 мкл добавьте 2–6 мкл буфера для лизиса, но не более 6 мкл.

2. Оптимизация хороших условий количественной ПЦР (температура отжига и т. д.) для реакции количественной ПЦР (условия реакции приведены в таблице 3-2).

Примечание. Попробуйте использовать оптимизированные условия для реакций qPCR, чтобы получить лучшие результаты.

Таблица 3-1: Подготовка реакционной системы ПЦР

1*: Концентрацию праймера можно регулировать в диапазоне 50-900 нМ, когда эффективность реакции праймера низкая.

Примечание. Систему количественной ПЦР можно настроить в соответствии с экспериментальными потребностями и моделью флуоресцентного циклера.Для количественной ПЦР в 50μl системы, отрегулируйте дозировку реагента пропорционально в соответствии с 20μл система.

2*: Выберите соответствующую конечную концентрацию эталонного красителя ROX в соответствии с количественным термоциклером флуоресценции.Наиболее подходящие концентрации эталонного красителя ROX для обычных амплификаторов для количественного анализа флуоресценции показаны в таблице ниже:

Таблица 3-2: Условия проведения qPCR представлены

Примечание. Чтобы получить наилучший эффект количественной ПЦР, можно использовать градиентную ПЦР для оптимизации условий реакции для разных матриц и разных праймеров.Условия реакции ПЦР различаются в зависимости от флуоресцентного анализатора, матрицы, праймера и т. д. В конкретной операции оптимальные условия реакции необходимо разработать в соответствии с конкретными условиями флуоресцентного количественного термоциклера, типом матрицы, размером интересующего фрагмента, последовательностью оснований амплифицируемого фрагмента, содержанием GC и длиной праймеров, включая температуру отжига, время реакции и т. д.

Принципы разработки праймеров для ПЦР в реальном времени

Прямой праймер и обратный праймер

Для ПЦР в реальном времени очень важен дизайн праймера.Праймеры связаны со специфичностью и эффективностью ПЦР-амплификации и могут быть разработаны с учетом следующих принципов:

◆ Длина праймера: 18-30 пар оснований.

◆ Содержание GC: 40-60%.

◆ Значение Tm: Программное обеспечение для проектирования грунтовок, такое как Primer 5, может определить значение Tm грунтовки.Значения Tm восходящего и нисходящего праймеров должны быть как можно ближе.Также можно использовать формулу расчета Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).При проведении ПЦР в качестве температуры отжига обычно выбирается температура ниже значения Tm праймера, равного 5 °C (соответствующее повышение температуры отжига может повысить специфичность реакции ПЦР).

◆ Праймеры и продукты ПЦР:

◆ Длина продукта ПЦР-амплификации праймеров дизайна предпочтительно составляет 100–150 п.н.

◆ По возможности следует избегать применения грунтовок во вторичной структурной области шаблона.

◆ Избегайте образования 2 или более комплементарных оснований между 3'-концами вышестоящего и нижестоящего праймеров.

◆ 3'-концевое основание праймера не может содержать 3 дополнительных последовательных G или C.

◆ Сами праймеры не могут иметь комплементарных структур, иначе образуется шпилька, влияющая на ПЦР-амплификацию.

◆ ATCG должен быть как можно более равномерно распределен в последовательности праймера, и следует избегать 3'-концевого основания в виде T.

Приложение1：CЭл ДиректОТ-кПЦР Комплект компонентовпакет добавок

1. Раствор для лизиса клеток