Хорошо известно, что в центральной догме РНК является посредником транскрипции между экспрессией ДНК и белка.По сравнению с обнаружением ДНК обнаружение РНК может более объективно отражать экспрессию генов в организмах.Эксперименты с РНК включают: qRT-PCR, RNA-Seq, обнаружение слитых генов и т. д. Исходя из характеристик самой РНК (сахарное кольцо РНК имеет на одну свободную гидроксильную группу больше, чем сахарное кольцо ДНК), в сочетании с большим количеством РНКаз в окружающей среде, РНК более нестабильна и легче поддается деградации, чем ДНК.Мусор на входе, мусор на выходе, если качество РНК нехорошее, то и результаты эксперимента должны быть неудовлетворительными, конкретно проявляющимися в виде неточных данных или плохой воспроизводимости.Поэтому больше внимания следует уделять обработке РНК, и связь контроля качества также более важна для обеспечения точности и достоверности последующих экспериментальных данных.

Для контроля качества РНК обычно используются следующие широко используемые методы:

• Спектрофотометрия
• электрофорез в агарозном геле
• Биоанализатор Agilent
• флуоресцентный количественный ПЦР в реальном времени
• Метод флуоресцентного красителя Qubit

01 Спектрофотометрия

РНК имеет сопряженные двойные связи и имеет пик поглощения при длине волны 260 нм.По закону Ламберта-Бера мы можем рассчитать концентрацию РНК по пику поглощения при 260 нм.Кроме того, мы также можем рассчитать чистоту РНК по соотношению пиков поглощения 260, 280 и 230 нм.280 нм и 230 нм — это пики поглощения белков и малых молекул соответственно.Соотношение A260/A280 и A260/A230 квалифицированной чистоты РНК должно быть больше 2. Если оно меньше 2, это означает, что в образце РНК есть примеси белка или малых молекул, и его необходимо снова очистить.Источники загрязнения будут влиять на последующие эксперименты, например, снижать эффективность амплификации реакций ПЦР, что приведет к неточным количественным результатам.Чистота РНК оказывает большое влияние на последующие результаты, поэтому спектрофотометрия обычно является незаменимым звеном контроля качества на первом этапе экспериментов с нуклеиновыми кислотами.

Рисунок 1. Типичный спектр поглощения РНК/ДНК

02 Электрофорез в агарозном геле

Помимо чистоты целостность РНК также является одним из важных показателей для оценки качества РНК.Деградация РНК приведет к большому количеству коротких фрагментов в образце, поэтому количество фрагментов РНК, которые могут быть эффективно обнаружены и покрыты эталонной последовательностью, будет уменьшено.Целостность РНК можно проверить электрофорезом тотальной РНК на 1% агарозном геле.Этот метод позволяет настроить гель самостоятельно или использовать сборную систему E-Gel™ для проверки целостности.Более 80% всей РНК составляет рибосомная РНК, большая часть которой состоит из 28S и 18S рРНК (в системах млекопитающих).РНК хорошего качества будет показывать две очевидные яркие полосы, которые представляют собой яркие полосы 28S и 18S, соответственно, размером 5 кб и 2 кб, и соотношение будет близко к 2:1.Если он находится в диффузном состоянии, это означает, что образец РНК мог подвергнуться деградации, и рекомендуется использовать метод, описанный ниже, для дальнейшего тестирования качества РНК.

Рисунок 2. Сравнение деградированной (дорожка 2) и интактной РНК (дорожка 3) при электрофорезе в агарозном геле.

03 Биоанализатор Agilent

В дополнение к описанному выше методу электрофореза в агарозном геле, который может помочь нам просто и быстро определить целостность РНК, мы также можем использовать биоанализатор Agilent для определения целостности РНК.Он использует комбинацию микрофлюидики, капиллярного электрофореза и флуоресценции для оценки концентрации и целостности РНК.Используя встроенный алгоритм анализа профиля образца РНК, биоанализатор Agilent может рассчитать эталонное значение целостности РНК, число целостности РНК (далее RIN) [1].Чем больше значение RIN, тем выше целостность РНК (1 — крайне деградированная, 10 — наиболее полная).В некоторых экспериментах с РНК предлагается использовать RIN в качестве параметра для оценки качества.Взяв в качестве примера эксперименты по секвенированию с высокой пропускной способностью (далее NGS), в рекомендациях Oncomine™ Human Immune Repertoire, которые используются для обнаружения В- и Т-клеточных антигенных рецепторов в серии панелей Thermo Fisher Oncomine, предполагается, что образцы со значениями RIN выше 4 могут быть измерены более эффективно для считывания и клонирования (рис. 3).Существуют разные рекомендуемые диапазоны для разных панелей, и часто более высокий RIN может дать более эффективные данные.

Рисунок 3. В экспериментах Oncomine™ Human Immune Repertoire образцы с RIN выше 4 могут обнаруживать более эффективные считывания и клоны Т-клеток.【2】

Однако значение RIN также имеет некоторые ограничения.Хотя RIN имеет высокую корреляцию с качеством экспериментальных данных NGS, он не подходит для образцов FFPE.Образцы FFPE подвергались химической обработке в течение длительного времени, и экстрагированная РНК обычно имеет относительно низкое значение RIN.Однако это не означает, что эффективные данные эксперимента должны быть неудовлетворительными.Чтобы точно оценить качество образцов FFPE, нам необходимо использовать измерения, отличные от RIN.В дополнение к RIN биоанализатор Agilent также может рассчитывать значение DV200 в качестве параметра оценки качества РНК.DV200 — это параметр, который рассчитывает долю фрагментов размером более 200 п.н. в образце РНК.DV200 является лучшим индикатором качества образца FFPE, чем RIN.Для РНК, выделенной с помощью FFPE, она имеет очень высокую корреляцию с количеством генов, которые могут быть эффективно обнаружены, и разнообразием генов [3].Хотя DV200 может компенсировать недостатки в определении качества FFPE, биоанализатор Agilent по-прежнему не может всесторонне анализировать проблемы качества в образцах РНК, включая наличие в образцах ингибиторов.Сами ингибиторы могут влиять на эффективность амплификации последующих экспериментов и уменьшать количество полезных данных.Чтобы узнать, есть ли в образце ингибитор, мы можем использовать метод количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени, описанный далее.

04 флуоресцентный количественный ПЦР в реальном времени

Метод флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени может не только обнаруживать ингибиторы в образце, но и точно отражать качество РНК в образце FFPE.По сравнению с биологическими анализаторами Agilent количественные приборы флуоресценции в реальном времени более популярны в крупных биологических лабораториях из-за их более широкого применения.Чтобы проверить качество образцов РНК, нам нужно только приобрести или подготовить праймеры-зонды для внутренних эталонных генов, таких как GUSB (кат. № Hs00939627).Используя этот набор праймеров, зондов и стандартов (общая РНК известной концентрации) для проведения абсолютных количественных экспериментов, можно рассчитать эффективную концентрацию фрагмента РНК в качестве стандарта оценки качества РНК (сокращенно Функциональный количественный анализ РНК (FRQ)).В тесте NGS мы обнаружили, что FRQ образцов РНК имеет очень высокую корреляцию с эффективным объемом данных.Для всех образцов, превышающих 0,2 нг/мкл FRQ, не менее 70 % считываний могут эффективно охватывать эталонную последовательность (рис. 4).

На рисунке 4 значение FRQ, определенное количественным методом флуоресценции, имеет очень высокую корреляцию (R2>0,9) с эффективными данными, полученными в эксперименте NGS.Красная линия — это значение FRQ, равное 0,2 нг/мкл (log10 = -0,7).【4】

Метод количественной ПЦР в реальном времени не только применим к образцам FFPE, но и позволяет эффективно отслеживать ингибиторы в образцах.Мы можем добавить образец для обнаружения в реакционную систему с внутренним положительным контролем (IPC) и его анализом, а затем выполнить количественный анализ флуоресценции для получения значения Ct.Если значение Ct отстает от значения Ct в реакции без образца, это указывает на то, что ингибитор присутствует в образце и подавляет эффективность амплификации в реакции.

05 Метод флуоресцентного красителя Qubit

Qubit Fluorometer — это наиболее часто используемый небольшой прибор для определения концентрации и чистоты нуклеиновых кислот, который прост в эксплуатации и имеется почти в каждой лаборатории молекулярной биологии.Он точно рассчитывает концентрацию нуклеиновой кислоты путем обнаружения флуоресцентного красителя, связывающего нуклеиновую кислоту (реагент для обнаружения Qubit).Qubit обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может точно определять количество РНК вплоть до концентрации пг/мкл.В дополнение к хорошо известной способности точного количественного определения концентрации нуклеиновых кислот последняя новая модель Thermo Fisher, Qubit 4.0, также может определять целостность РНК.Система обнаружения РНК Qubit 4.0 (анализ РНК IQ) определяет целостность РНК путем одновременного обнаружения двух конкретных флуоресцентных красителей.Эти два флуоресцентных красителя могут связываться с большими и маленькими фрагментами РНК соответственно.Эти два флуоресцентных красителя показывают пропорцию больших фрагментов РНК в образце, и исходя из этого можно рассчитать значение IQ (целостность и качество), представляющее качество РНК.Значение IQ применимо как к образцам FFPE, так и к образцам без FFPE и оказывает большое влияние на последующее качество секвенирования.Взяв в качестве примера эксперименты NGS, в тестовых экспериментах RNA-Seq, проведенных на платформе Ion torrent™, большинство образцов со значениями IQ выше 4 имели не менее 50 % эффективных считываний (рис. 5).По сравнению с вышеупомянутыми методами обнаружения Qubit IQ Assay не только более удобен в работе и занимает меньше времени (в пределах пяти минут), но также имеет большую корреляцию между измеренным значением параметра IQ и качеством данных последующих экспериментов.

На рис. 5 существует большая корреляция между значением IQ Qubit RNA и картированными прочтениями RNA-Seq.【5】

Благодаря приведенному выше введению я считаю, что у всех есть достаточное представление о различных методах контроля качества РНК.На практике можно выбратьсоответствующий метод в соответствии с типом образца и существующими инструментами.Только хорошо контролируя качество РНК, мы можем избежать неудач последующих экспериментов, вызванных плохим качеством образцов, что сэкономит драгоценное время, энергию и деньги.

Справочные продукты:

Набор для выделения тотальной РНК животных

Набор для выделения общей клеточной РНК

Рекомендации

【1】Шредер А., Мюллер О., Стокер С. и соавт.RIN: номер целостности РНК для присвоения значений целостности измерениям РНК.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Руководство пользователя Oncomine Human Immune Repertoire (номер публикации MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 Лия К. Вемас, Чарльз Э. Вуд, Брайан Н. Чорли, Кэрол Л. Яук, Гейл М. Нельсон, Сьюзан Д. Хестер, Улучшенные показатели качества для оценки РНК, полученной из архивных образцов тканей, фиксированных формалином и залитых парафином, Токсикологические науки, том 170, выпуск 2, август 2019 г., страницы 357–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/