Стерилизация наконечников пипеток, пробирок для ЭП и т. д.

1. Приготовьте 0,1% (одну тысячную) ДЭПК (высокотоксичное вещество) с деионизированной водой, осторожно используйте в вытяжном шкафу и храните при температуре 4°C в защищенном от света месте;

Вода DEPC — это чистая вода, обработанная DEPC и стерилизованная при высокой температуре и высоком давлении.Проверено на отсутствие РНКазы, ДНКазы и протеиназы.

2. Поместите наконечник пипетки и пробирку EP в 0,1% DEPC и убедитесь, что наконечник пипетки и пробирка EP заполнены 0,1% DEP.

3. Защитить от света, оставить на ночь (12-24 часа)

4. Коробку с наконечником и трубкой EP не нужно замачивать в DEPC.После грубого удаления воды DEPC из наконечника или трубки EP упакуйте ее и заверните.

5. 121 градус Цельсия, 30 мин.

6. 180 градусов Цельсия, сушка в течение нескольких часов (минимум 3 часа)

Примечание: а.Надевайте латексные перчатки и маски при работе с DEPC!b или без стерилизации DEPC, 130 ℃, 90 минут в автоклаве (во многих лабораториях дважды проводится высокотемпературная стерилизация)

Рекомендации по извлечению РНК

Два основных феномена неудачной изоляции тканевой РНК

Деградация РНК и остатки примесей в тканях,Что касается деградации, давайте сначала посмотрим, почему РНК, экстрагированная из культивируемых клеток, не подвергается деградации легко.Все существующие реагенты для выделения РНК содержат компоненты, которые быстро ингибируют РНКазу.Добавьте лизат к культивируемым клеткам и просто перемешайте его, все клетки можно тщательно смешать с лизатом, и клетки полностью лизируются.После лизиса клеток активные ингредиенты лизата немедленно ингибируют внутриклеточную РНКазу, поэтому РНК остается неповрежденной.Другими словами, поскольку культивируемые клетки легко и полностью контактируют с лизатом, их РНК не так легко разрушается;с другой стороны, РНК в ткани легко разрушается, потому что клеткам в ткани нелегко быстро связаться с лизатом.благодаря достаточному контакту.Так,Если предположить, что существует способ превратить ткань в единую клетку, ингибируя активность РНК, проблема деградации может быть полностью решена.

Измельчение жидким азотом является наиболее эффективным из таких методов.Однако метод измельчения жидким азотом очень сложен, особенно при большом количестве образцов.Это привело к следующей лучшей вещи: гомогенизатору.гомогенизаторметод не рассматривает вопрос о том, как ингибируется активность РНКазы до того, как клетки вступят в контакт с лизатом, а скорее молится о том, чтобы скорость разрушения ткани была выше, чем скорость, с которой внутриклеточная РНКаза разрушает RN.

Эффект электрического гомогенизатора лучше,и эффект стеклянного гомогенизатора плохой, но в целом метод гомогенизатора не может предотвратить явление деградации.Поэтому, если экстракция ухудшается, следует использовать оригинальный электрический гомогенизатор для измельчения жидким азотом;оригинальный стеклянный гомогенизатор следует заменить на электрический гомогенизатор или непосредственно измельчить жидким азотом.Проблема решаема почти на 100%.решиться.

Проблема остатков примесей, влияющая на последующие эксперименты, имеет более разнообразные причины, чем деградация, и решения, соответственно, разные.В заключение,если в ткани есть деградация или остаточные примеси, необходимо оптимизировать метод экстракции/реагент для конкретного экспериментального материала.Вам не нужно использовать свои драгоценные образцы для оптимизации: вы можете купить на рынке несколько мелких животных, таких как рыба / курица, взять соответствующую часть материала для выделения РНК, а другую часть для выделения белка — измельчить с экстрактом рта, желудка и кишечника.

Целевая РНК из выделенной РНК используется для различных последующих экспериментов, и требования к ее качеству различны.

Для построения библиотеки кДНК необходима целостность РНК без остатков ингибиторов ферментативных реакций;Northern требует более высокой целостности РНК и более низких требований к остаткам ингибиторов ферментативных реакций;ОТ-ПЦР не требует слишком высокой целостности РНК,но угнетает ферментативные реакции.Требования к остаткам строгие.Вход определяет выход;каждый раз, когда целью является получение РНК наивысшей чистоты, это будет стоить людям и деньгам.

Сбор/хранение проб

Факторы, влияющие на деградацию После того, как образец покидает живой организм/или исходную среду для роста, эндогенные ферменты в образце начинают расщеплять РНК,скорость деградации связана с содержанием эндогенных ферментов и температурой.Традиционно существует только два способа полного ингибирования активности эндогенных ферментов: немедленное добавление лизата и тщательная и быстрая гомогенизация;разрезать на мелкие кусочки и сразу же заморозить в жидком азоте.Оба подхода требуют быстрой работы.Последний подходит для всех образцов, тогда как первый подходит только для тканей с низким содержанием клеток и эндогенных ферментов и легче гомогенизируется.В частности, растительную ткань, печень, тимус, поджелудочную железу, селезенку, мозг, жир, мышечную ткань и т. д. лучше всего заморозить жидким азотом перед продолжением.

Фрагментация и гомогенизация образцов

Факторы, влияющие на деградацию и фрагментацию образца выходадля тщательной гомогенизации, что для полного и полного высвобождения РНК.Клетки могут быть непосредственно гомогенизированы без разрушения.Ткани можно гомогенизировать только после их разрыва.Дрожжи и бактерии должны быть разрушены соответствующими ферментами, прежде чем их можно будет гомогенизировать.Ткани с более низким содержанием эндогенных ферментов и более легкой гомогенизацией могут быть измельчены и гомогенизированы одновременно в лизате с помощью гомогенизатора;растительная ткань, печень, вилочковая железа, поджелудочная железа, селезенка, мозг, жир, мышечная ткань и другие образцы. Они либо богаты эндогенными ферментами, либо не легко гомогенизируются,поэтому разрушение ткани и гомогенизацию необходимо проводить отдельно.Наиболее надежным и продуктивным методом дробления является измельчение жидким азотом, а самым надежным методом гомогенизации — использование электрического гомогенизатора.Особое примечание относительно измельчения жидким азотом: образец нельзя размораживать в течение всего процесса измельчения, так как эндогенные ферменты с большей вероятностью будут функционировать при замораживании.

Выбор лизата

Влияющие на удобство работы факторы и остаточные эндогенные примеси Обычно используемые лизирующие растворы могут практически ингибировать активность РНКазы.Поэтому ключевым моментом выбора лизирующего раствора является рассмотрение в сочетании с методом очистки.Есть одно исключение:в образцах с высоким содержанием эндогенных ферментов рекомендуется использовать лизат, содержащий фенол, для повышения способности инактивировать эндогенные ферменты.

Выбор метода очистки

Факторы, влияющие на остаточные эндогенные примеси, скорость экстракции. Для чистых образцов, таких как клетки, удовлетворительные результаты могут быть получены практически любым доступным методом очистки.Но для многих других образцов, особенно с высоким содержанием примесей, таких как растения, печень, бактерии и т. д., выбор подходящего метода очистки имеет решающее значение.Метод центробежной очистки на колонке имеет высокую скорость экстракции и может эффективно удалять примеси, влияющие на последующую ферментативную реакцию РНК, но он дорог (Foregene может предложить экономичные наборы, подробнее нажмитездесь);с использованием экономичных и классических методов очистки, таких как осаждение LiCl, также можно получить удовлетворительные результаты, но время работы велико..

«Три дисциплины и восемь направлений» для выделения РНК

Дисциплина 1:Положите конец загрязнению экзогенными ферментами.

Примечание 1:Строго в масках и перчатках.

Заметка 2:Центрифужные пробирки, наконечники наконечников, пипеточные стержни, резервуары для электрофореза и экспериментальные столы, задействованные в эксперименте, следует тщательно утилизировать.

Заметка 3:Реагенты/растворы, используемые в эксперименте, особенно вода, не должны содержать РНКазы.

Дисциплина 2:Блокируют активность эндогенных ферментов

Примечание 4:Выберите подходящий метод гомогенизации.

Примечание 5:Выберите подходящий лизат.

Примечание 6:Контролируйте начальное количество образца.

Дисциплина 3:Уточните цель извлечения

Примечание 7:Когда любая система лизата приближается к максимальному начальному количеству образца, вероятность успеха экстракции резко падает.

Примечание 8:Единственным экономическим критерием успешного выделения РНК является успех последующих экспериментов, а не выход.

Топ-10 источников загрязнения РНКазой

1. Пальцы являются первым источником экзогенных ферментов, поэтому перчатки необходимо носить и часто менять.Кроме того, маски также необходимо носить, поскольку дыхание также является важным источником ферментов.Дополнительным преимуществом ношения перчаточной маски является защита экспериментатора.

2. Наконечники пипеток, центрифужные пробирки, пипетки — РНКаза не может быть инактивирована одной стерилизацией, поэтому наконечники пипеток и центрифужные пробирки следует обрабатывать DEPC, даже если они помечены как обработанные DEPC.Пипетку лучше всего использовать специальную, перед применением протереть ее ватным тампоном с 75% спиртом, особенно стержень;кроме того, ни в коем случае не используйте съемник головок.

3. Вода/буфер не должны содержать РНКазы.

4. По крайней мере, тестовый стол должен быть протерт ватными тампонами, содержащими 75% спирта.

5. Эндогенная РНКаза Все ткани содержат эндогенные ферменты, поэтому быстрое замораживание тканей жидким азотом — лучший способ уменьшить деградацию.Метод хранения/измельчения жидким азотом действительно неудобен, но это единственный способ для тканей с высоким уровнем эндогенных ферментов.

6. Образцы РНК Продукты экстракции РНК могут содержать следы загрязнения РНКазой.

7. Экстракция плазмиды. Для деградации РНК при экстракции плазмиды часто используется РНКаза, а оставшуюся РНКазу следует расщеплять протеиназой К и экстрагировать с помощью PCI.

8. Хранение РНК Даже при хранении при низкой температуре следовые количества РНКазы вызывают деградацию РНК.Лучшее решение для долговременного сохранения РНК — суспензия соль/спирт, поскольку спирт ингибирует всю ферментативную активность при низких температурах.

9. Когда катионы (Ca, Mg) содержат эти ионы, нагревание при 80°C в течение 5 минут вызовет расщепление РНК, поэтому, если РНК необходимо нагреть, консервирующий раствор должен содержать хелатирующий агент (1 мМ цитрата натрия, pH 6,4).

10. Ферменты, используемые в последующих экспериментах, могут быть загрязнены РНКазой.

10 советов по извлечению РНК

1: Быстро предотвратить активность РНКазы.Образцы быстро замораживают после сбора, а РНКаза инактивируется быстрым действием во время лизиса.

2: Выберите подходящий метод экстракции для ткани с высоким содержанием рибозимов, а для жировой ткани лучше всего использовать метод, содержащий фенол.

3: Качество предсказания требует Нозерна, создание библиотеки кДНК требует высокой целостности, а ОТ-ПЦР и RPA (анализ защиты от рибонуклеазы) не требуют высокой целостности.Для ОТ-ПЦР требуется высокая чистота (остатки ингибиторов ферментов).

4: Тщательная гомогенизация является ключом к повышению выхода и снижению деградации.

5: Проверьте целостность обнаружения электрофореза РНК, 28S:18S = 2:1 является полным признаком, 1:1 также приемлем для большинства экспериментов.

6: Удаление ДНК для ОТ-ПЦР, матричный анализ Для удаления ДНК лучше всего использовать ДНКазу I.

7: Уменьшите загрязнение экзогенными ферментами – ферменты не могут быть импортированы извне.

8: При концентрировании нуклеиновой кислоты с низкой концентрацией следует добавить реагент для соосаждения.Но чтобы предотвратить соосаждение, содержащее ферменты и загрязнение ДНК.

9: Тщательно растворить РНК, при необходимости прогреть при 65°С в течение 5 минут.

подходящий способ хранения

Кратковременно может храниться при -20С, а при -80С длительное время.Первым шагом в улучшении выхода РНК является понимание того, что содержание РНК в разных образцах сильно различается.Высокое содержание (2-4 мкг/мг), такое как печень, поджелудочная железа, сердце, среднее содержание (0,05-2 мкг/мг), такое как мозг, эмбрион, почка, легкое, тимус, яичник, низкое содержание (<0,05 мкг/мг) мг), такое как мочевой пузырь, кости, жир.

1: Лизируйте клетки, чтобы высвободить RN — если РНК не высвобождается, выход будет снижен.Электрическая гомогенизация работает лучше, чем другие методы гомогенизации, но ее также может потребоваться сочетать с другими методами, такими как затирание жидким азотом, ферментативное расщепление (лизоцим/литиказа).

2: Оптимизация метода экстракции.Самыми большими проблемами методов на основе фенола являются неполная стратификация и частичная потеря РНК (невозможно полностью удалить надосадочную жидкость).Неполная стратификация связана с высоким содержанием нуклеиновых кислот и белков, что можно решить, увеличив количество используемого лизата или уменьшив количество образца.К жировой ткани добавляли стадию экстракции хлороформом.Потеря РНК может быть уменьшена путем обратного откачивания или путем удаления органического слоя с последующим центрифугированием.Самая большая проблема методов, основанных на колоночном центрифугировании, — это избыток образца.

Классические советы по извлечению

1. Очистка фенола: добавьте равный объем 1:1 фенол/хлороформ и энергично перемешайте в течение 1-2 минут.Центрифугировать на высокой скорости в течение 2 минут.Осторожно удалите супернатант (80-90%).Никогда не добирайтесь до среднего слоя.К смеси фенол/хлороформ можно добавить равный объем реакционного раствора и удалить надосадочную жидкость.Два супернатанта можно смешать вместе для осаждения нуклеиновой кислоты, чтобы улучшить выход.Не будьте слишком осторожны при смешивании и не пытайтесь удалить весь супернатант.

2. Промывка 70-80% этанолом: во время промывки нуклеиновая кислота должна быть суспендирована, чтобы обеспечить вымывание остаточной соли.При этом сразу после сливания этанола центрифугировать на высокой скорости в течение нескольких секунд, а затем удалить остатки этанола пипеткой.Растворить после стояния при комнатной температуре в течение 5-10 минут.

11. Добыча спецорганизаций

1. Волокнистая ткань. Ключом к извлечению РНК из волокнистой ткани, такой как сердечная/скелетная мышца, является полное разрушение ткани.Эти ткани имеют низкую плотность клеток, поэтому количество РНК на единицу веса ткани невелико, и лучше всего использовать как можно больше начального количества.Обязательно тщательно измельчите ткань в условиях замораживания.

2. Ткани с высоким содержанием белка/жира: содержание головного мозга/жира в овощах высокое.После экстракции PCI супернатант содержит белые хлопья.Надосадочную жидкость необходимо повторно экстрагировать хлороформом.

3. Ткани с высоким содержанием нуклеиновых кислот/рибозимов: селезенка/тимус имеет высокое содержание нуклеиновых кислот и рибозимов.Измельчение ткани в условиях замораживания с последующей быстрой гомогенизацией может эффективно инактивировать рибозимы.Однако, если лизат слишком вязкий (из-за высокого содержания нуклеиновых кислот), PCI-экстракция не сможет эффективно расслаиваться;добавление большего количества лизата может решить эту проблему.Несколько экстракций PCI могут удалить больше остаточной ДНК.Если сразу после добавления спирта образуется белый осадок, это свидетельствует о загрязнении ДНК.Повторная экстракция кислым PCI после растворения может удалить загрязнение ДНК.

4. Растительная ткань. Растительная ткань более сложна, чем животная.Как правило, растения измельчают в условиях жидкого азота, поэтому деградация РНК эндогенными ферментами встречается редко.Если проблема деградации не решена, она почти наверняка вызвана примесями, содержащимися в образце.Примеси, содержащиеся во многих растениях, приведут к образованию остатков, и причиной возникновения остатков часто является то, что эти примеси имеют некоторое сходство с РНК: вы осаждаете, и я осаждаю, и вы адсорбируете, и я адсорбирую.Эти характеристики определяют, что они являются очень сильными ингибиторами ферментов.

В настоящее время коммерческие реагенты для выделения РНК могут быть адаптированы почти ко всем животным тканям с небольшими корректировками, но существует несколько коммерческих реагентов для выделения РНК, которые могут подойти для большинства тканей растений.К счастью, Foregene может предоставить специальныенаборы для выделения растительной РНК, у нас естьНабор для выделения общей РНК растений, Набор для выделения общей РНК растений Plus.Последний специально разработан для растений с высоким содержанием полисахаридов и полифенолов.Для выделения РНК отзывы пользователей лаборатории особенно хороши.

12. Влияние замораживания и оттаивания образца. Замороженный образец может быть больше, и его необходимо разрезать перед использованием для выделения РНК.Образцы склонны плавиться (возможно, частично) во время резки.Замороженные образцы, возможно, потребуется взвесить перед выделением РНК, и во время этого процесса обязательно произойдет оттаивание.Иногда оттаивание образца также происходит в процессе измельчения в жидком азоте;или замороженный образец непосредственно добавляется в лизат без измельчения жидким азотом, и оттаивание обязательно произойдет до полной гомогенизации.Эксперименты показали, что замороженная ткань более склонна к деградации РНК при оттаивании, чем свежая ткань.Вероятная причина: процесс замораживания-оттаивания разрушает структуры внутри клетки, облегчая прямой контакт эндогенных ферментов с РНК.

13. Оценка качества РНК Обычно электрофорез используется для оценки целостности РНК, а A260/A280 используется для оценки чистоты РНК.Теоретически интактная РНК имеет соотношение 28S:18S = 2,7:1, и в большинстве данных подчеркивается соотношение 28S:18S = 2:1.Дело в том, что почти ни одна РНК, выделенная из образцов, кроме клеток, не находится в соотношении 2:1 (это было получено с помощью биоанализатора Agilent).

На результаты электрофореза РНК влияют многие факторы, включая вторичную структуру, условия электрофореза, загрузку образца, степень насыщения EB и т. д. Используйте нативный электрофорез для обнаружения РНК и используйте ДНК-маркер в качестве контроля.Если 28S на 2 КБ и 18S на 0,9 КБ чистые, а 28S: 18S > 1, целостность может удовлетворить требования большинства последующих экспериментов.

A260/A280 — индикатор, который вызвал много путаницы.Прежде всего необходимо уточнить исходное значение этого показателя для нуклеиновых кислот: чистая РНК, ее А260/280 = около 2,0.Чистая РНК является «причиной», а А260/А280 = 2 — «следствием».Сейчас все используют A260/A280 как «причину», думая, что «если A260/A280 = 2, то РНК чистая», что, естественно, приводит к путанице.

Если вам интересно, вы можете добавить в образец РНК немного реагента, который часто используется при экстракции, например, фенол, изотиоцианат гуанидина, ПЭГ и т. д., а затем измерить соотношение A260/A280.Реальность такова, что многие реагенты, используемые для выделения РНК, а также многие примеси в образце поглощают около A260 и A280, влияя на A260/A280.

Наиболее информативным подходом в настоящее время является сканирование образцов РНК в диапазоне 200-300 нм.Кривая чистой РНК имеет следующие характеристики: кривая гладкая, A230 и A260 представляют собой две точки перегиба, A300 близка к 0, A260/A280 = около 2,0 и A260/A230 = около 2,0.Если данные сканирования недоступны, необходимо также определить соотношение A260/A230, так как это соотношение более чувствительно к переносу всех примесей, влияющих на ферментативную реакцию.Учитывайте линейный диапазон прибора (0,1–0,5 для А260).

Есть еще два полезных явления: соотношение будет примерно на 0,3 ниже, когда A260/A280 измеряется в воде;в то время как отношение, измеренное в 10 мМ ЭДТА, примерно на 0,2 выше, чем измеренное в 1 мМ ЭДТА.

Сопутствующие товары:

Набор для выделения общей РНК в Китае Производитель и поставщик |Фореджин (foreivd.com)

Серия изоляции РНК Поставщики и фабрика |Китайские производители серии выделений РНК (foreivd.com)

Серия выделения РНК – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)