Эксперимент RT-qPCR включает в себя извлечение РНК и оценку качества, обратную транскрипцию и три этапа qPCR, на каждом этапе есть много предосторожностей, которые мы подробно расскажем ниже.

Ⅰ.Оценка качества РНК

В эксперименте RT-qPCR после завершения выделения РНК необходимо оценить качество РНК, а последующий эксперимент можно проводить только после его квалификации.Методы оценки включают спектрофотометр, гель-электрофорез Agilent, анализ Agilent 2100, среди которых наиболее часто используются спектрофотометр и метод детекции электрофореза в агарозном геле.Следует отметить, что эти два метода необходимо использовать вместе для завершения обнаружения и анализа концентрации, чистоты и целостности РНК, чтобы обеспечить качество РНК.

Связанный набор для выделения РНК: 

Набор для выделения общей клеточной РНК

Высокоочищенная и высококачественная тотальная РНК может быть получена из различных культивируемых клеток за 11 мин.

Набор для выделения тотальной РНК животных

Быстро и эффективно извлекайте тотальную РНК высокой чистоты и высокого качества из различных тканей животных.

Спектрофотометр:

Спектрофотометр в основном используется для определения концентрации и чистоты РНК, но он не может определить целостность РНК и геномных остатков.Среди них А260/280 и А260/230 являются важными параметрами для определения чистоты РНК, а чистоту РНК можно определить по колебаниям их значений:

1. 1,9 < A260/280 < 2,1, что указывает на хорошую чистоту РНК;A260/280<1,9, что указывает на то, что в РНК может быть остаток белка;A260/280>2,1, что указывает на возможную частичную деградацию РНК, что может быть дополнительно подтверждено электрофорезом в агарозном геле.

2. 2,0 < A260/230 < 2,2, что указывает на хорошую чистоту РНК;A260/230<2,0, что указывает на то, что в РНК могут быть остатки органических реагентов, таких как фенолы, этанол или сахара.

Электрофорез в агарозном геле:

Электрофорез в агарозном геле позволяет анализировать целостность РНК, остатки генома и белка, но не может точно определить концентрацию РНК или обнаружить остатки органических реагентов.Возьмем, к примеру, эукариотические матрицы РНК:

1. РНК подвергали электрофорезу в агарозном геле.Если на карте геля было только три одиночные полосы 28sРНК, 18sРНК и 5.8sРНК, это указывает на то, что выделенная РНК не повреждена.Если есть явление перетаскивания, это указывает на частичную деградацию РНК.

2. Если между отверстием для клея и полосой 28sРНК есть одна яркая полоса, это может быть остаток геномной ДНК.

3. Если в клеевом отверстии появляются полосы, это свидетельствует о возможном наличии остатков белка и других высокомолекулярных веществ.

Ⅱ. Обратная транскрипция

После завершения выделения РНК ее необходимо преобразовать в кДНК для последующих экспериментов, поэтому шаг обращения имеет важное значение.Обратная транскрипция будет введена путем выбора обратной транскриптазы и праймера:

Выбор обратной транскриптазы:

Типичные обратные транскриптазы включают RTase AMV и RTase MMLV.РНКаза H RTase AMV обладает высокой активностью, короткой длиной синтеза, низким объемом синтеза и хорошей термостабильностью (42 ~ 55 ℃).Активность РНКазы H MMLV RTase слабая, длина синтеза велика, количество синтеза велико, а термостабильность плохая (37 ~ 42 ℃).

Поскольку фермент РНКаза H выполняет функцию деградации матрицы РНК, MMLV со слабой активностью РНКазы H следует предпочтительно выбирать во время обратной транскрипции, и после более поздней генной инженерии термостабильность MMLV достигла качественного скачка.Принимая ForegeneОбратная транскриптаза Foreasy (M-MLV для обратной транскрипции) например, это новая обратная транскриптаза, экспрессируемая в бактериях, сконструированных E. coli с использованием технологии генетической рекомбинации.Это рекомбинантная ДНК-полимераза, которая синтезирует комплементарную цепь ДНК из одноцепочечной РНК, ДНК или гибрида РНК:ДНК.Он не обладает активностью РНКазы H, высокой стабильностью, сильным сродством к РНК и высокой чувствительностью обнаружения.

 

Обратная транскриптаза Foreasy (M-MLV для обратной транскрипции)

Подбор грунтовки:

Обычно праймеры для ОТ делятся на три категории: олиго-dT, случайные праймеры и ген-специфические праймеры.Выберите подходящие грунтовки для использования в соответствии с различными экспериментальными требованиями.

1. Если матрица эукариотического происхождения и поздняя кДНК используется для рутинной ПЦР-амплификации, рекомендуется Oligo (dT);Если последующий эксперимент используется только для количественной ПЦР, Oligo (dT) рекомендуется смешивать со случайными праймерами для повышения эффективности обратной транскрипции.

2. Если матрица получена из прокариот, для обратной транскрипции следует выбрать случайные праймеры или ген-специфичные праймеры.

Ⅲ.кПЦР

Количественное определение флуоресценции в основном зависит от выбора количественных методов, принципов дизайна праймеров, выбора ROX, конфигурации реакционной системы и настройки условий реакции и т. д.

Выбор количественных методов:

Количественные методы делятся на относительные количественные методы и абсолютные количественные методы.Относительная количественная оценка может быть использована для обнаружения влияния определенных методов лечения на экспрессию генов, выявления различий в экспрессии генов в разное время и сравнения различий в экспрессии генов в разных тканях.Абсолютное количественное определение может определить количество нуклеиновой кислоты в вирусе и так далее.При проведении экспериментов мы должны выбирать подходящие количественные методы в соответствии с нашими собственными экспериментами.

Принципы оформления праймера:

Дизайн праймера для количественной ПЦР напрямую связан с эффективностью амплификации и специфичностью продукта.Таким образом, правильное проектирование хороших праймеров является первым шагом к успешной количественной ПЦР.При разработке праймера следует обращать внимание на следующие принципы при соблюдении принципа обычного дизайна праймера:

1. Длина целевого фрагмента регулируется в пределах от 100 до 300 п.н.;

2. Дизайн кросс-экзона, чтобы избежать влияния геномной ДНК;

3. Разработанные праймеры необходимо проверить на эффективность амплификации, и только когда эффективность амплификации достигнет стандарта (90-110 %), их можно использовать для количественных экспериментов;

4. Концентрация праймера обычно оптимизируется между 0,1 мкм и 1,0 мкм.

ВыборРОКС:

В процессе количественной реакции ROX может равномерно регулировать разность оптических путей, погрешность пипетирования или разность объемов, вызванную испарением и конденсацией, улучшая воспроизводимость результатов.Однако следует отметить, что выбор ROX связан с прибором.Если прибор qPCR имеет функцию автоматической коррекции разницы между лунками, ему не нужно добавлять ROX;в противном случае необходимо добавить коррекцию ROX.Небольшие партнеры при покупке реагентов должны соответствовать используемому инструменту, чтобы выбрать правильный ROX, чтобы избежать ошибок в будущем.

Приготовление реакционной системы:

Предпочтительны реакционные объемы 20 мкл и 50 мкл.При разработке системы следует обратить внимание на следующие моменты:

1. Реакционная система должна быть подготовлена ​​путем проветривания сверхчистого рабочего места, новый ddH₂O используется для каждого эксперимента;

2. Каждый эксперимент должен подготовить NTC, чтобы проверить, есть ли загрязнение в системе, и каждая пара праймеров должна выполнить NTC при подготовке системы;

3. Чтобы определить, есть ли остаток гДНК в матрице РНК, НЗТ можно приготовить для каждого образца для обнаружения;

4. При подготовке системы рекомендуется делать не менее 3-х технических повторов на один образец;

5. Когда матрица представляет собой кДНК, рекомендуется развести ее в 5-10 раз, чтобы уменьшить ингибирующий эффект системы обратной транскрипции на эксперимент КПЦР.Количество шаблонов лучше исследовать по градиенту, чтобы значение CT находилось в пределах 20-30;

6. Определить необходимое количество реакций, увеличить на 5-10% исходя из количества реакций и рассчитать объемное число конфигураций;

7, система готовится с использованием принципа предварительного смешивания, смешивания после центрифугирования и обеспечения отсутствия пузырьков;

8, насколько это возможно, чтобы выбрать поддерживающие расходные материалы.

Связанный набор RT-qPCR