Основа дизайна праймера (99% проблем могут быть решены)
1. Длина букваря: учебник требует 15-30 п.н., обычно около 20 п.н.Фактическое состояние лучше иметь 18-24 п.н. для обеспечения специфичности, но чем длиннее, тем лучше, слишком длинный праймер также снизит специфичность и уменьшит выход.
2. Диапазон амплификации праймера: подходит 200–500 п.н., и фрагмент может быть расширен до 10 т.п.н. при определенных условиях.
3. Основа праймера: содержание G+C должно быть 40-60%, слишком мало G+C усиливает эффект нехорошо, слишком много G+C легко приводит к появлению неспецифических полос.ATGC лучше всего распределять случайным образом, избегая кластеров из более чем 5 пуриновых или пиримидиновых нуклеотидов.Multi-gc для 5'-конца и промежуточных последовательностей для повышения стабильности, избегайте богатого GC на 3'-конце, отсутствия GC для последних 3 оснований или отсутствия GC для 3 из последних 5 оснований.
4. Избегайте вторичной структуры в праймерах и избегайте комплементации между двумя праймерами, особенно комплементации на 3'-конце, иначе будет сформирован димер праймера и будут генерированы неспецифические амплифицированные полосы.
5. Основания на 3'-конце праймеров, особенно последнее и предпоследнее основания, должны быть строго спарены, чтобы избежать сбоя ПЦР из-за неспаренных терминальных оснований.
6. Праймеры имеют или могут быть добавлены с соответствующими сайтами расщепления, и амплифицированная последовательность-мишень предпочтительно должна иметь соответствующие сайты расщепления, что очень полезно для анализа расщепления или молекулярного клонирования.
7. Специфичность праймеров: праймеры не должны иметь очевидной гомологии с другими последовательностями в базе данных последовательностей нуклеиновых кислот.
8. Научитесь пользоваться программами: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, Primer3 (эта онлайн-конструкция работает лучше всего).
Вышеупомянутое содержимое может решить как минимум 99% проблем с дизайном праймера.
Контролируйте детали дизайна праймера
1. Длина грунтовки
Общая длина праймера составляет 18~30 оснований.В общем, наиболее важным фактором, определяющим температуру отжига праймера, является длина праймера.Температура отжига грунтовки обычно выбирается (значение Tm -5 ℃), а некоторые напрямую используют значение Tm.Следующие формулы можно использовать для приблизительного расчета температуры отжига грунтовок.
Когда длина праймера меньше 20 пар оснований: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Когда длина праймера больше 20 п.н.: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/длина-5℃
Кроме того, многие программы также могут использоваться для расчета температуры отжига, принцип расчета будет другим, поэтому иногда расчетное значение может иметь небольшой разрыв.Для оптимизации реакций ПЦР используются самые короткие праймеры, обеспечивающие температуру отжига не ниже 54℃ для наилучшей эффективности и специфичности.
В целом специфичность праймера увеличивается в четыре раза с каждым дополнительным нуклеотидом, так что минимальная длина праймера для большинства применений составляет 18 нуклеотидов.Верхний предел длины праймера не очень важен, в основном связан с эффективностью реакции.Из-за энтропии, чем длиннее праймер, тем ниже скорость его отжига для связывания с ДНК-мишенью с образованием стабильной двухцепочечной матрицы для связывания ДНК-полимеразы.
При использовании программного обеспечения для разработки праймеров длина праймеров может определяться значением TM в свою очередь, особенно для праймеров для количественной флуоресцентной ПЦР, TM = 60 ℃ или около того следует контролировать.
2.Содержимое ГК
Как правило, содержание G+C в последовательностях праймеров составляет 40–60%, а содержание GC и значение Tm пары праймеров должны быть согласованы.Если праймер имеет серьезную склонность к GC или AT, к 5'-концу праймера можно добавить соответствующее количество хвоста A, T или G и C.
3. Температура отжига
Температура отжига должна быть на 5 ℃ ниже температуры расцепления.Если количество оснований праймеров невелико, температуру отжига можно соответствующим образом увеличить, что может повысить специфичность ПЦР.Если количество оснований велико, температура отжига может быть соответствующим образом снижена.Разница температур отжига между парой праймеров в 4 ℃ ~ 6 ℃ не повлияет на выход ПЦР, но в идеале температура отжига пары праймеров одинакова и может варьироваться в пределах 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Избегайте области вторичной структуры шаблона усиления.
При выборе амплифицируемого фрагмента лучше избегать области вторичной структуры шаблона.Стабильная вторичная структура целевого фрагмента может быть предсказана и оценена соответствующим компьютерным программным обеспечением, которое полезно для выбора шаблона.Экспериментальные результаты показывают, что расширение часто оказывается безуспешным, когда свободная энергия (△G) расширяемой области составляет менее 58,6 лкДж/моль.
5. Несовпадение с ДНК-мишенью
Когда амплифицированная последовательность ДНК-мишени велика, праймер может связываться с несколькими частями ДНК-мишени, что приводит к появлению нескольких полос в результате.На этот раз необходимо использовать тестирование программного обеспечения BLAST, сайт:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Выберите Выровнять две последовательности (bl2seq).
Вставка последовательностей праймеров в зону 1 и последовательностей ДНК-мишеней в зону 2 является взаимозаменяемой, и BLAST вычисляет комплементарные, антисмысловые и другие возможности, поэтому пользователям не нужно замечать, являются ли обе цепи смысловыми цепями.Вы также можете ввести номер GI, если вы знаете номер GI последовательности в базе данных, поэтому вам не нужно вставлять большой фрагмент последовательности.Наконец, нажмите «Выровнять в 3», чтобы увидеть, есть ли у праймера несколько гомологичных сайтов в ДНК-мишени.
6. Первичный терминал
3'-конец праймера - это место, где начинается удлинение, поэтому важно не допустить, чтобы несоответствия начинались там.3'-конец не должен состоять из более чем 3 последовательных G или C, потому что это приведет к ошибочному запуску праймера в области обогащенной G+C последовательности.3'-конец не может образовывать никакой вторичной структуры, за исключением специальных реакций ПЦР (АС-ПЦР), 3'-конец праймера не может быть несовпадающим.Например, если кодирующая область амплифицируется, 3'-конец праймера не должен заканчиваться в третьем положении кодона, поскольку третье положение кодона склонно к вырождению, что повлияет на специфичность и эффективность амплификации.При использовании праймеров для аннексии обратитесь к таблице использования кодонов, обратите внимание на биологические предпочтения, не используйте праймеры для аннексии на 3'-конце и используйте более высокую концентрацию праймеров (1 мкм-3 мкм).
7. Вторичная структура праймеров
Сами праймеры не должны иметь комплементарных последовательностей, иначе сами праймеры будут складываться в шпилькообразные структуры, и эта вторичная структура будет влиять на связывание праймеров и матриц из-за стерических затруднений.Если используется искусственное суждение, непрерывные комплементарные основания самих праймеров не должны превышать 3 п.н.Между двумя праймерами не должно быть комплементарности, особенно следует избегать комплементарного перекрытия 3'-конца, чтобы предотвратить образование димеров праймеров.Как правило, между парой праймеров должно быть не более 4 последовательных оснований гомологии или комплементарности.
8. Добавьте маркеры или локусы
5'-конец мало влияет на специфичность амплификации и поэтому может быть модифицирован без влияния на специфичность амплификации.Модификация 5'-конца праймера включала: добавление сайта рестрикции фермента;Меченый биотин, флуоресценция, дигоксин, Eu3+ и т. д. Ввести последовательности ДНК, связывающие белок;Введение сайтов мутаций, вставка и отсутствие мутационных последовательностей, введение промоторных последовательностей и т. д. Дополнительные основания в той или иной степени влияют на эффективность амплификации и повышают вероятность образования димеров праймеров, но для следующего шага необходимо сделать некоторые уступки.Дополнительные последовательности, отсутствующие в последовательности-мишени, такие как сайты рестрикции и промоторные последовательности, могут быть добавлены к 5'-концу праймера без влияния на специфичность.Эти последовательности не включаются в расчет значений Tm праймеров, но их следует тестировать на комплементарность и внутреннюю вторичную структуру.
9. Субклоны
В большинстве случаев ПЦР — это только предварительное клонирование, а затем нам нужно субклонировать целевой фрагмент в различные векторы, поэтому нам нужно спроектировать дополнительные базы для следующей операции на этапе ПЦР.
Некоторые последовательности, предназначенные для субклонирования, приведены ниже.
Добавлен сайт рестрикции эндонуклеазы рестрикции
Добавление сайтов рестрикции фермента является наиболее часто используемым методом субклонирования продуктов ПЦР.Как правило, сайт расщепления составляет шесть оснований, в дополнение к 5'-концу сайта расщепления необходимо добавить 2 ~ 3 защитных основания.Однако количество защитных оснований, необходимых для разных ферментов, различно.Например, SalⅠ не требует защитного основания, EcoRⅤ требует 1 защитного основания, NotⅠ требует 2 защитных оснований, а Hind Ⅲ требует 3 защитных оснований.
LIC добавляет хвост
Полное название LIC — независимое от лигирования клонирование, метод клонирования, изобретенный Navogen специально для своей части вектора pET.Носитель pET, полученный методом LIC, имеет некомплементарные 12-15 нуклеотидных одноцепочечных липких концов, которые дополняют соответствующие липкие концы на целевом фрагменте вставки.В целях амплификации 5'-последовательность праймера вставленного фрагмента должна дополнять вектор LIC.3'→5' экстранектная активность ДНК-полимеразы Т4 может через короткое время образовывать одноцепочечный липкий конец на вставленном фрагменте.Поскольку продукт может быть образован только при взаимном отжиге подготовленного фрагмента вставки и вектора, этот метод является очень быстрым и эффективным и направлен на клонирование.
Направленный клон TA добавляет хвост
Клонирование TA не позволяло направить фрагмент в вектор, поэтому позже Invitrogen представила вектор, который мог нацеливаться на клонирование, который содержал четыре заметных основания GTGGS на одном конце.Следовательно, при разработке праймеров для ПЦР следует соответствующим образом добавлять комплементарные последовательности, чтобы фрагменты можно было «ориентировать».
Если у вас мало времени, вы можете попробовать прямой синтез, комбинируя ген с вектором, что мы называем синтезом гена ET в мышцах.
D. Метод клонирования In-Fusion
Не требуется ни лигазы, ни длительной реакции.Пока последовательность на обоих концах линеаризованного вектора введена в конструкцию праймеров, а затем продукт ПЦР и линеаризованный вектор добавляют в инфузионный ферментный раствор, содержащий BSA, и помещают на полчаса при комнатной температуре, можно проводить трансформацию.Этот метод особенно подходит для преобразования больших объемов.
10. Грунтовка слияния
Иногда о дизайне праймеров известна только ограниченная информация о последовательности.Например, если известна только аминокислотная последовательность, можно сконструировать объединяющий праймер.Праймер слияния представляет собой смесь различных последовательностей, представляющих все возможные варианты оснований, которые кодируют одну аминокислоту.Чтобы повысить специфичность, вы можете обратиться к таблице использования кодонов, чтобы уменьшить аннексию в соответствии с базовыми предпочтениями различных организмов.Гипоксантин можно сочетать со всеми основами для снижения температуры отжига грунтовки.Не используйте присоединенные основания на 3'-конце праймера, потому что отжига последних 3 оснований на 3'-конце достаточно, чтобы инициировать ПЦР в неправильном месте.Используются более высокие концентрации праймеров (от 1 мкМ до 3 мкМ), поскольку праймеры во многих смесях для аннексии неспецифичны для целевой матрицы.
сырье для ПЦРконтроль
1. Количество грунтовки
Концентрация каждого праймера составляет 0,1 ~ 1 мкмоль или 10 ~ 100 пмоль.Требуемый результат лучше получить с наименьшим количеством грунтовки.Высокая концентрация праймера вызовет несоответствие и неспецифическую амплификацию, а также увеличит вероятность образования димеров между праймерами.
2. Концентрация праймера
Концентрация праймеров влияет на специфичность.Оптимальная концентрация праймера обычно составляет от 0,1 до 0,5 мкМ.Более высокие концентрации праймеров приводят к амплификации неспецифических продуктов.
3. Температура отжига грунтовки
Еще одним важным параметром для грунтовок является температура плавления (Tm).Это температура, при которой 50% праймеров и комплементарных последовательностей представлены двухцепочечными молекулами ДНК.Tm требуется для установки температуры отжига ПЦР.В идеале температура отжига должна быть достаточно низкой, чтобы обеспечить эффективный отжиг праймеров с последовательностью-мишенью, но достаточно высокой, чтобы уменьшить неспецифическое связывание.Разумная температура отжига от 55℃ до 70℃.Температура отжига обычно устанавливается на 5 ℃ ниже, чем Tm грунтовки.
Существует несколько формул для установки Tm, которые сильно различаются в зависимости от используемой формулы и последовательности праймеров.Поскольку в большинстве формул указано приблизительное значение Tm, все температуры отжига являются лишь отправной точкой.Специфичность можно улучшить, проанализировав несколько реакций, которые постепенно повышают температуру отжига.Начните ниже расчетной Tm-5 ℃ и постепенно увеличивайте температуру отжига с шагом 2 ℃.Более высокая температура отжига уменьшит образование димеров праймеров и неспецифических продуктов.Для достижения наилучших результатов два праймера должны иметь приблизительные значения Tm.Если разница Tm пар праймеров превышает 5 ℃, праймеры будут показывать значительный фальстарт при использовании более низкой температуры отжига в цикле.Если Tm двух праймеров разные, установите температуру отжига на 5 ℃ ниже самой низкой Tm.В качестве альтернативы, для повышения специфичности, сначала можно провести пять циклов при температурах отжига, рассчитанных на более высокую Tm, а затем остальные циклы при температурах отжига, рассчитанных на более низкую Tm.Это позволяет получить частичную копию целевого шаблона в жестких условиях.
4. Чистота и стабильность грунтовки
Стандартная чистота пользовательских праймеров достаточна для большинства применений ПЦР.Удаление бензоильных и изобутилильных групп путем обессоливания минимально и поэтому не мешает проведению ПЦР.В некоторых приложениях требуется очистка для удаления любых неполноразмерных последовательностей в процессе синтеза.Эти укороченные последовательности возникают из-за того, что эффективность химического синтеза ДНК не равна 100%.Это круговой процесс, в котором используются повторяющиеся химические реакции, когда каждое основание добавляется для создания ДНК от 3' до 5'.Вы можете потерпеть неудачу в любом цикле.Более длинные праймеры, особенно содержащие более 50 оснований, имеют большую долю укороченных последовательностей и могут потребовать очистки.
Выход праймеров зависит от эффективности синтетической химии и метода очистки.Биофармацевтические компании, такие как Cytology и Shengong, используют минимальную единицу OD для обеспечения общего выхода олигонуклеозидов.Заказные грунтовки поставляются в виде сухого порошка.Лучше всего повторно растворить праймеры в ТЭ, чтобы конечная концентрация составила 100 мкМ.TE лучше, чем деионизированная вода, потому что pH воды часто бывает кислым и вызывает гидролиз олигонуклеозидов.
Стабильность праймеров зависит от условий хранения.Сухой порошок и растворенные грунтовки следует хранить при температуре -20℃.Праймеры, растворенные в ТЭ в концентрациях более 10 мкМ, могут стабильно храниться при температуре -20°С в течение 6 месяцев, но могут храниться только при комнатной температуре (от 15°С до 30°С) менее 1 недели.Сухие порошковые грунтовки можно хранить при температуре -20°С не менее 1 года и при комнатной температуре (от 15°С до 30°С) до 2 месяцев.
5. Ферменты и их концентрации
В настоящее время используемая ДНК-полимераза Taq представляет собой в основном генно-инженерный фермент, синтезируемый колиформными бактериями.Количество фермента, необходимое для катализа типичной реакции ПЦР, составляет около 2,5 ед. (относится к общему реакционному объему 100 мкл).Если концентрация слишком высока, это может привести к неспецифической амплификации;если концентрация слишком низкая, количество синтетического продукта будет уменьшено.
6. Качество и концентрация dNTP
Качество dNTP тесно связано с концентрацией и эффективностью ПЦР-амплификации.Порошок dNTP гранулирован, и его изменчивость теряет свою биологическую активность при неправильном хранении.Раствор dNTP является кислым, и его следует использовать в высокой концентрации, с буферным раствором 1M NaOH или 1M Tris.HCL, чтобы отрегулировать его pH до 7,0 ~ 7,5, небольшое количество субупаковки, хранение в замороженном виде при -20 ℃.Многократное замораживание-оттаивание приведет к деградации dNTP.В реакции ПЦР dNTP должен составлять 50 ~ 200 мкмоль/л.Особенно следует обратить внимание на то, чтобы концентрация четырех DNTPS была одинаковой (препарат с равными молями).Если концентрация любого из них отличается от других (выше или ниже), возникнет несоответствие.Слишком низкая концентрация снизит выход продуктов ПЦР.dNTP может соединяться с Mg2+ и снижать концентрацию свободного Mg2+.
7. Матричная (ген-мишень) нуклеиновая кислота
Количество и степень очистки матричной нуклеиновой кислоты является одним из ключевых звеньев успеха или неудачи ПЦР.Традиционные методы очистки ДНК обычно используют SDS и протеазу K для расщепления и уничтожения образцов.Основные функции SDS: растворять липиды и белки на клеточной мембране, таким образом разрушая клеточную мембрану путем растворения мембранных белков, и диссоциировать ядерные белки в клетке, SDS также может соединяться с белками и осаждаться;Протеаза К может гидролизовать и переваривать белки, особенно гистоны, связанные с ДНК, а затем использовать органический растворитель фенол и хлороформ для извлечения белков и других компонентов клетки, а также использовать этанол или изопропиловый спирт для осаждения нуклеиновой кислоты.Выделенную нуклеиновую кислоту можно использовать в качестве матрицы для реакций ПЦР.Для образцов общего клинического обнаружения можно использовать быстрый и простой метод растворения клеток, лизирования патогенов, расщепления и удаления белков из хромосом до свободных генов-мишеней, а также непосредственно использовать для ПЦР-амплификации.Для экстракции матрицы РНК обычно используется метод изотиоцианата гуанидина или протеазы K, чтобы предотвратить деградацию РНК РНКазой.
8. Концентрация Mg2+
Mg2+ оказывает значительное влияние на специфичность и выход ПЦР-амплификации.В общей реакции ПЦР, когда концентрация различных dNTP составляет 200 мкмоль/л, соответствующая концентрация Mg2+ составляет 1,5 ~ 2,0 ммоль/л.Слишком высокая концентрация Mg2+ снижает специфичность реакции, происходит неспецифическая амплификация, слишком низкая концентрация снижает активность ДНК-полимеразы Taq, что приводит к уменьшению количества продуктов реакции.
Ионы магния влияют на несколько аспектов ПЦР, таких как активность ДНК-полимеразы, влияющая на выход;Другим примером является отжиг праймеров, который влияет на специфичность.dNTP и матрица связываются с ионом магния, уменьшая количество свободного иона магния, необходимого для активности фермента.Оптимальная концентрация ионов магния различается для разных пар праймеров и матриц, но типичная начальная концентрация ПЦР с 200 мкМ dNTP составляет 1,5 мМ (примечание: для количественной ПЦР в реальном времени используйте раствор ионов магния с концентрацией от 3 до 5 мМ с флуоресцентным зондом).Более высокие концентрации свободных ионов магния увеличивают выход, но также увеличивают неспецифическую амплификацию и снижают точность.Для определения оптимальной концентрации проводили титрование ионами магния с шагом 0,5 мМ от 1 мМ до 3 мМ.Чтобы уменьшить зависимость от оптимизации ионов магния, можно использовать ДНК-полимеразу Platinum Taq.Платиновая ДНК-полимераза Taq способна поддерживать функцию в более широком диапазоне концентраций ионов магния, чем ДНК-полимераза Taq, и поэтому требует меньшей оптимизации.
9. Добавки, стимулирующие ПЦР
Оптимизация температуры отжига, дизайна праймера и концентрации ионов магния достаточна для высокоспецифичной амплификации большинства матриц;однако для некоторых шаблонов, в том числе с высоким содержанием GC, требуются дополнительные меры.Добавки, влияющие на температуру плавления ДНК, обеспечивают еще один способ улучшить специфичность и выход продукта.Для достижения наилучших результатов требуется полная денатурация шаблона.
Кроме того, вторичная структура предотвращает связывание праймеров и удлинение фермента.
Добавки для ПЦР, в том числе формамид, ДМСО, глицерин, бетаин и раствор для усиления ПЦР, усиливают амплификацию.Их возможный механизм заключается в снижении температуры плавления, что способствует отжигу праймеров и расширению ДНК-полимеразы через область вторичной структуры.Решение PCRx имеет и другие преимущества.При использовании ДНК-полимеразы Platinum Taq и ДНК-полимеразы Platinum Pfx требуется минимальная оптимизация ионов магния.Таким образом, метод Platinum сочетается с добавкой для повышения специфичности при одновременном снижении зависимости от третьего подхода, оптимизации ионов магния.Для достижения наилучших результатов следует оптимизировать концентрацию добавок, особенно ДМСО, формамида и глицерина, которые ингибируют ДНК-полимеразу Taq.
10. Горячий старт
ПЦР с горячим стартом является одним из наиболее важных методов повышения специфичности ПЦР в дополнение к хорошему дизайну праймеров.Хотя оптимальная температура удлинения ДНК-полимеразы Taq составляет 72 ℃, полимераза остается активной при комнатной температуре.Таким образом, неспецифические продукты образуются при температуре выдержки ниже температуры отжига при подготовке реакции ПЦР и в начале термоцикла.После образования эти неспецифические продукты эффективно амплифицируются.ПЦР с горячим стартом особенно эффективна, когда сайты, используемые для дизайна праймеров, ограничены расположением генетических элементов, таких как сайт-направленные мутации, экспрессионное клонирование или конструирование и манипулирование генетическими элементами, используемыми для инженерии ДНК.
Обычный метод ограничения активности ДНК-полимеразы Taq заключается в приготовлении реакционного раствора для ПЦР на льду и помещении его в предварительно нагретый прибор для ПЦР.Этот метод прост и недорог, но он не завершает активность фермента и, следовательно, не исключает полностью амплификацию неспецифических продуктов.
Термическое праймирование задерживает синтез ДНК путем ингибирования основного компонента до тех пор, пока аппарат ПЦР не достигнет температуры денатурации.Большинство ручных методов термической инициации, включая отсроченное добавление ДНК-полимеразы Taq, громоздки, особенно для приложений с высокой пропускной способностью.В других методах термической грунтовки используется парафиновый экран для закрытия основных компонентов, включая ионы магния или ферменты, или для физической изоляции реактивных компонентов, таких как шаблоны и буферы.Во время термического цикла различные компоненты высвобождаются и смешиваются друг с другом по мере плавления парафина.Как и метод ручного горячего старта, метод восковой защиты громоздок и подвержен загрязнению и не подходит для приложений с высокой пропускной способностью.
Платиновая ДНК-полимераза удобна и эффективна для автоматической ПЦР с горячим стартом.Platinum Taq ДНК-полимераза состоит из рекомбинантной ДНК-полимеразы Taq в сочетании с моноклональным антителом против ДНК-полимеразы Taq.Антитела готовят методом ПЦР для ингибирования активности фермента при длительном температурном выдерживании.ДНК-полимераза Taq была высвобождена в реакцию во время изоляции при 94 ℃ на стадии денатурации, восстанавливая полную полимеразную активность.В отличие от химически модифицированной ДНК-полимеразы Taq для термической инициации, фермент Platinum не требует длительной изоляции при 94 ℃ (от 10 до 15 минут) для активации полимеразы.При использовании ДНК-полимеразы PlatinumTaq 90% активности ДНК-полимеразы Taq восстанавливалось через 2 минуты при 94℃.
11. Гнездо-ПЦР
Последовательные раунды амплификации с использованием вложенных праймеров могут улучшить специфичность и чувствительность.Первый раунд представляет собой стандартную амплификацию от 15 до 20 циклов.Небольшую фракцию исходного продукта амплификации разбавляли в 100–1000 раз и добавляли во второй цикл амплификации в течение 15–20 циклов.В качестве альтернативы размер исходного амплифицированного продукта можно определить с помощью гель-очистки.Во втором раунде амплификации используется вложенный праймер, который может связываться с последовательностью-мишенью внутри первого праймера.Использование вложенной ПЦР снижает возможность амплификации нескольких сайтов-мишеней, потому что имеется мало последовательностей-мишеней, комплементарных обоим наборам праймеров.Такое же общее количество циклов (от 30 до 40) с теми же праймерами амплифицирует неспецифические сайты.Гнездовая ПЦР повышает чувствительность ограниченных последовательностей-мишеней (например, редких мРНК) и улучшает специфичность сложной ПКРС (например, 5'-RACE).
12. Нисходящая ПЦР
Нисходящая ПЦР повышает специфичность за счет использования жестких условий отжига для первых нескольких циклов ПЦР.Цикл начинается при температуре отжига примерно на 5 ℃ выше расчетной Tm, затем каждый цикл снижается на 1–2 ℃ до тех пор, пока температура отжига не станет ниже Tm 5 ℃.Будет амплифицироваться только целевой шаблон с наивысшей гомологией.Эти продукты продолжают расширяться в последующих циклах, вытесняя амплифицированные неспецифические продукты.Нисходящая ПЦР полезна для методов, в которых степень гомологии между праймером и матрицей-мишенью неизвестна, таких как снятие отпечатков пальцев ДНК AFLP.
Связанные наборы для ПЦР
2 × Герой ПЦРTMСистема Mix имеет более высокую толерантность к ингибиторам ПЦР, чем обычная система PCR Mix, и может легко справляться с ПЦР-амплификации различных сложных матриц.Уникальная реакционная система и высокоэффективный Taq Hero обеспечивают более высокую эффективность амплификации, специфичность и чувствительность реакции ПЦР.
Более высокая эффективность усиления
Он обладает 5'→3' ДНК-полимеразной активностью и 5'→3' экзонуклеазной активностью без 3'→5' экзонуклеазной активности.
ПЦР в реальном времени Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Специфичность — оптимизированный буфер и фермент Taq с горячим стартом могут предотвратить неспецифическую амплификацию и образование димеров праймеров.
Высокая чувствительность — может обнаруживать низкие копии шаблона.
В наборе используется уникальный реагент обратной транскрипции Foregene и ДНК-полимераза Foregene HotStar Taq в сочетании с уникальной реакционной системой для эффективного повышения эффективности амплификации и специфичности реакции.
Время публикации: 09 мая 2023 г.
