RT-qPCR разработан на основе обычной технологии PCR.Он добавляет флуоресцентные химические вещества (флуоресцентные красители или флуоресцентные зонды) в традиционную реакционную систему ПЦР и обнаруживает процесс отжига и удлинения ПЦР в реальном времени в соответствии с их различными люминесцентными механизмами.Изменения флуоресцентного сигнала в среде используются для расчета величины изменения продукта в каждом цикле ПЦР.В настоящее время наиболее распространенными методами являются метод флуоресцентного красителя и метод зонда.

Метод флуоресцентного окрашивания:
Некоторые флуоресцентные красители, такие как SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO и др., не излучают свет сами по себе, а излучают флуоресценцию после связывания с малой бороздкой двухцепочечной ДНК.Поэтому в начале реакции ПЦР машина не может обнаружить флуоресцентный сигнал.Когда реакция переходит к стадии отжига-удлинения (двухэтапный метод) или стадии удлинения (трехэтапный метод), в это время открываются двойные цепи, и новая ДНК-полимераза. Во время синтеза нити флуоресцентные молекулы объединяются в малой бороздке двухцепочечной ДНК и излучают флуоресценцию.По мере увеличения количества циклов ПЦР все больше и больше красителей связываются с двухцепочечной ДНК, и флуоресцентный сигнал также постоянно усиливается.Возьмем, к примеру, SYBR Green Ⅰ.
Метод зонда:
Зонд Taqman является наиболее часто используемым зондом для гидролиза.На 5'-конце зонда есть флуоресцентная группа, обычно FAM.Сам зонд представляет собой последовательность, комплементарную гену-мишени.На 3'-конце флуорофора находится группа гашения флуоресценции.Согласно принципу резонансной передачи энергии флуоресценции (резонансный перенос энергии Фёрстера, FRET), когда репортерная флуоресцентная группа (донорная флуоресцентная молекула) и гасящая флуоресцентная группа (акцепторная флуоресцентная молекула) Когда спектр возбуждения перекрывается и расстояние очень близко (7-10 нм), возбуждение донорной молекулы может индуцировать флуоресценцию акцепторной молекулы, в то время как аутофлуоресценция ослабляется.Следовательно, в начале реакции ПЦР, когда зонд свободен и не поврежден в системе, репортерная флуоресцентная группа не будет излучать флуоресценцию.При отжиге праймер и зонд связываются с матрицей.На стадии удлинения полимераза непрерывно синтезирует новые цепи.ДНК-полимераза обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью.Достигнув зонда, ДНК-полимераза гидролизует зонд из матрицы, отделяет репортерную флуоресцентную группу от флуоресцентной группы гасителя и высвобождает флуоресцентный сигнал.Поскольку между зондом и матрицей существует взаимосвязь один к одному, метод зонда превосходит метод красителя с точки зрения точности и чувствительности теста.

Рис. 1. Принцип количественной ОТ-ПЦР

Дизайн грунтовки
Принципы:

Праймеры должны быть сконструированы в консервативной области серии нуклеиновых кислот и обладать специфичностью.

Лучше всего использовать последовательность кДНК, также приемлема последовательность мРНК.Если нет, узнайте дизайн области cds последовательности ДНК.
Длина флуоресцентного количественного продукта составляет 80–150 п.н., самая длинная — 300 п.н., длина праймера обычно составляет 17–25 оснований, а разница между восходящим и нисходящим праймерами не должна быть слишком большой.

Содержание G+C составляет от 40% до 60%, а лучше всего 45-55%.
Значение ТМ находится в пределах 58-62 градусов.
Старайтесь избегать димеров праймеров и собственных димеров (не должно появляться более 4 пар последовательных комплементарных оснований) структура шпильки, если это неизбежно, сделайте ΔG<4,5 кДж/моль* Если вы не можете гарантировать, что гДНК была удалена во время обратной транскрипции Очистите, лучше спроектировать праймеры с *3'-концом интрона, которые нельзя модифицировать, и, чтобы избежать областей, богатых AT, GC, избегайте T/C, A/G праймеров с непрерывной структурой (2-3) и не-
специфическая Гомология гетерогенно амплифицированной последовательности предпочтительно составляет менее 70% или имеет гомологию из 8 комплементарных оснований.
База данных:
CottonFGD поиск по ключевым словам
Дизайн грунтовки:
Дизайн праймера IDT-qPCR

Рис. 2. Страница онлайн-инструмента IDT для разработки учебников

Отображение страницы результатов на рис. 3
Дизайн праймеров днРНК:
днкРНК:те же шаги, что и мРНК.
микроРНК:Принцип метода стволовой петли: поскольку все микроРНК представляют собой короткие последовательности длиной около 23 нуклеотидов, прямое обнаружение ПЦР невозможно, поэтому используется инструмент последовательности стволовой петли.Последовательность «стебель-петля» представляет собой одноцепочечную ДНК длиной около 50 нуклеотидов, которая сама по себе может образовывать структуру шпильки.3 'Конец может быть сконструирован как последовательность, комплементарная частичному фрагменту миРНК, затем целевая миРНК может быть присоединена к последовательности "стебель-петля" во время обратной транскрипции, а общая длина может достигать 70 п.н., что соответствует длине амплифицированного продукта, определенной с помощью количественной ПЦР.Дизайн праймера хвостовой микроРНК.
Обнаружение, специфичное для усиления:
Онлайн-база данных бластов: бласты CottonFGD по сходству последовательностей
Локальный взрыв: обратитесь к использованию Blast+ для локального взрыва, linux и macos могут напрямую установить локальную базу данных, систему win10 также можно сделать после установки ubuntu bash.Создать локальную базу данных взрыва и локальный взрыв;открыть ubuntu bash на win10.
Примечание: хлопчатник высокогорный и хлопчатник морских островов являются тетраплоидными культурами, поэтому результатом взрыва часто будет два или более совпадения.В прошлом при использовании NAU cds в качестве базы данных для проведения бласта можно было найти два гомологичных гена с небольшими различиями в SNP.Обычно два гомологичных гена не могут быть разделены дизайном праймера, поэтому их рассматривают как одно и то же.Если есть очевидная вставка, праймер обычно конструируют на вставке, но это может привести к вторичной структуре праймера. Свободная энергия становится выше, что приводит к снижению эффективности амплификации, но это неизбежно.

Определение вторичной структуры праймера:
Шаги:открыть олиго 7 → ввести последовательность шаблона → закрыть подокно → сохранить → найти праймер на шаблоне, нажать Ctrl + D, чтобы установить длину праймера → проанализировать различные вторичные структуры, такие как тело самодимеризации, гетеродимер, шпилька, несоответствие и т. д. Последние два изображения на рисунке 4 являются результатами тестирования праймеров.Результат переднего праймера хороший, нет очевидной структуры димера и шпильки, нет непрерывных комплементарных оснований, а абсолютное значение свободной энергии меньше 4,5, в то время как задний праймер показывает непрерывность. 6 оснований комплементарны, а свободная энергия составляет 8,8;кроме того, на 3'-конце появляется более серьезный димер, и появляется димер из 4 последовательных оснований.Хотя свободная энергия невелика, 3'-димер Chl может серьезно влиять на специфичность и эффективность амплификации.Кроме того, необходимо проверить наличие шпилек, гетеродимеров и несоответствий.

Рис. 3. Результаты обнаружения oligo7
Обнаружение эффективности усиления:
Эффективность амплификации реакции ПЦР серьезно влияет на результаты ПЦР.Также в qRT-PCR эффективность амплификации особенно важна для количественных результатов.Удалите другие вещества, машины и протоколы в реакционном буфере.Качество праймеров также оказывает большое влияние на эффективность амплификации qRT-PCR.Чтобы обеспечить точность результатов, как относительная количественная оценка флуоресценции, так и абсолютная количественная оценка флуоресценции должны определять эффективность амплификации праймеров.Признано, что эффективная эффективность амплификации qRT-PCR составляет от 85% до 115%.Есть два метода:
1. Метод стандартной кривой:
а.Смешайте кДНК
б.Градиентное разбавление
в.кПЦР
д.Уравнение линейной регрессии для расчета эффективности усиления
2. ЛинРегПЦР
LinRegPCR — это программа для анализа данных ОТ-ПЦР в реальном времени, также называемых данными количественной ПЦР (кПЦР), на основе SYBR Green или аналогичного химического состава.Программа использует данные, не скорректированные по базовой линии, выполняет коррекцию базовой линии для каждого образца отдельно, определяет окно линейности, а затем использует линейный регрессионный анализ, чтобы подобрать прямую линию через набор данных ПЦР.По наклону этой линии рассчитывается эффективность ПЦР каждого отдельного образца.Средняя эффективность ПЦР на ампликон и значение Ct на образец используются для расчета начальной концентрации на образец, выраженной в произвольных единицах флуоресценции.Ввод и вывод данных осуществляется через электронную таблицу Excel.Только образец
требуется смешивание, без градиента
требуются шаги:(Возьмите в качестве примера Bole CFX96, не совсем машину с понятным ABI)
эксперимент:это стандартный эксперимент КПЦР.
Вывод данных КПЦР:LinRegPCR может распознавать две формы выходных файлов: RDML или результат количественной амплификации.Фактически, это значение обнаружения в реальном времени числа циклов и сигнала флуоресценции машиной, а усиление достигается путем анализа значения изменения флуоресценции эффективности линейного сегмента.
Выбор данных: Теоретически значение RDML должно быть пригодным для использования.Предполагается, что проблема моего компьютера заключается в том, что программное обеспечение не может распознать RDML, поэтому у меня есть выходное значение excel в качестве исходных данных.Рекомендуется сначала выполнить грубый скрининг данных, например, неудачное добавление образцов и т. д. Точки могут быть удалены в выходных данных (конечно, вы не можете их удалить, LinRegPCR проигнорирует эти точки на более позднем этапе).

Рис. 5. Экспорт данных qPCR.

Рис. 6. Выбор образцов-кандидатов.

Ввод данных:Откройте файл Qualification Amplification results.xls, → откройте LinRegPCR → файл → прочитайте из Excel → выберите параметры, как показано на рисунке 7 → OK → нажмите «Определить базовые уровни».

Рис. 7. Шаги ввода данных linRegPCR

Результат:Если нет повторения, группировка не требуется.Если есть повторение, группировку можно отредактировать в группировке выборки, а в идентификатор вписать название гена, и тогда этот же ген будет автоматически сгруппирован.Наконец, щелкните файл, экспортируйте в Excel и просмотрите результаты.Будут отображены эффективность амплификации и результаты R2 для каждой лунки.Во-вторых, если разделить на группы, то будет отображаться скорректированная средняя эффективность усиления.Убедитесь, что эффективность амплификации каждого праймера составляет от 85% до 115%.Если он слишком велик или слишком мал, это означает, что эффективность амплификации праймера низкая.

Рис. 8 Результат и вывод данных

Экспериментальный процесс:
Требования к качеству РНК:
Чистота:1,72,0 указывает на то, что может быть остаточный изотиоцианат.Чистая нуклеиновая кислота A260/A230 должна быть около 2. Если наблюдается сильное поглощение при 230 нм, это указывает на наличие органических соединений, таких как ионы фената.Кроме того, его можно обнаружить с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле.Укажите маркер, потому что ssRNA не имеет денатурации и логарифм молекулярной массы не имеет линейной зависимости, и молекулярная масса не может быть правильно выражена.Концентрация: теоретическинетменее 100 нг / мкл, если концентрация слишком низкая, чистота обычно низкая, а не высокая

Гель РНК Fig9

Кроме того, если образец является ценным и концентрация РНК высока, рекомендуется разделить его на аликвоты после экстракции и разбавить РНК до конечной концентрации 100-300 нг/мкл для обратной транскрипции.Впроцесс обратной транскрипции, когда мРНК транскрибируется, олиго(dt) праймеры, которые могут специфически связываться с хвостами полиА, используются для обратной транскрипции, в то время как днРНК и циркРНК используют случайные гексамерные (случайные 6 мер) праймеры для обратной транскрипции тотальной РНК.Сейчас многие компании выпустили специальные комплекты хвостовиков.Для метода «стебель-петля» метод «хвоста» является более удобным, высокопроизводительным и реагентосберегающим, но эффект различения микроРНК одного и того же семейства не должен быть таким хорошим, как метод «стебель-петля».Каждый набор для обратной транскрипции имеет требования к концентрации геноспецифических праймеров (стеблевых петель).Внутренняя ссылка, используемая для микроРНК, - это U6.В процессе инверсии ствол-петля трубка U6 должна быть перевернута отдельно, а передний и задний капсюли U6 должны быть добавлены непосредственно.Как circRNA, так и lncRNA могут использовать HKG в качестве внутреннего эталона.Вобнаружение кДНК,
если нет проблем с РНК, кДНК тоже должна подойти.Однако, если преследуется цель совершенства эксперимента, лучше всего использовать внутренний эталонный ген (эталонный ген, RG), который может отличить гДНК от cds.Как правило, RG является геном домашнего хозяйства., HKG), как показано на рисунке 10;В то время я производил запасной белок сои и использовал интроны, содержащие актин-7, в качестве внутреннего эталона.Размер амплифицированного фрагмента этого праймера в гДНК составил 452 п.н., а если в качестве матрицы использовалась кДНК, то 142 п.н.Затем результаты испытаний показали, что часть кДНК действительно загрязнена гДНК, а также доказали отсутствие проблем с результатом обратной транскрипции, и ее можно было использовать в качестве матрицы для ПЦР.Бесполезно проводить электрофорез в агарозном геле непосредственно с кДНК, и это диффузная полоса, что неубедительно.

Рис. 10. Обнаружение кДНК

Определение условий количественной ПЦРкак правило, нет проблем в соответствии с протоколом комплекта, в основном на этапе значения tm.Если некоторые праймеры плохо подобраны во время разработки праймеров, что приводит к большой разнице между значением tm и теоретической температурой 60°C, рекомендуется после смешивания кДНК провести градиентную ПЦР с праймерами и постараться не устанавливать температуру без полос в качестве значения TM.

Анализ данных

Обычный метод количественной ПЦР относительной флуоресценции в основном соответствует 2-ΔΔCT.Шаблон обработки данных.

Сопутствующие товары:

ПЦР в реальном времени легко^TM –Такман

ПЦР в реальном времени легко^TM –СИБР ЗЕЛЕНЫЙ I

RT Easy I (мастер-премикс для синтеза первой цепи кДНК)

RT Easy II (мастер-премикс для синтеза первой цепи кДНК для количественной ПЦР)