Все говорят о принципе эксперимента qRT-PCR, дизайне праймеров, интерпретации результатов и т. д., но я думаю, что должен поделиться с вами экспериментальной работой qRT-PCR.Он небольшой, но речь идет о результатах.
Прежде чем делать qRT-PCR, нам нужно иметь четкое представление о нашей собственной РНК и методах работы.Ведь наши усилия направлены на получение результата, а не просто на практику.Поэтому перед выполнением qRT-PCR нам необходимо определить следующие проблемы (некоторые из которых применимы только к SYBR).
1 Вы уверены, что ваша РНК не деградировала?
NanoDrop 2000 может определять только концентрацию и чистоту РНК, но не может определять целостность РНК.
Значение РНК (число интенсивности РНК) может отражать целостность РНК, определяемую системой биоанализатора Agilent 2100.
Рис. Схематическая диаграмма значений RIN для различных образцов РНК (эукариоты)
Однако в лабораториях обычно нет биоанализатора Agilent 2100.В этом случае мы можем обнаружить через формальдегидный гель, но потребность в общем количестве РНК высока, поэтому самым быстрым методом является использование обычного гель-электрофореза.Необходимо находиться в среде, свободной от нуклеаз, поэтому необходимо промыть резервуар для электрофореза, бутыль с золем, гелевую скобу и расчесать водой DEPC.Агароза также не содержит нуклеаз (пока она только что открыта), и загрузочный буфер должен быть как можно более свежим, с 1,2% геля.
Обратите внимание, что гель должен быть полностью растворен, иначе появятся неоднородные полосы, как показано в образце 9 на рисунке.Если напряжение слишком высокое или работа слишком длительная, это приведет к выделению тепла и вызовет деградацию РНК, поэтому напряжение и время следует контролировать разумно.Кроме того, прогон геля также может дополнительно определить, есть ли в образце остатки ДНК, и наблюдать, есть ли большое количество оставшихся полос в дозирующей лунке.
Фигура.Гель-электрофорез обнаружения РНК
2 Вы уверены в концентрации вашей кДНК?
Опыт старших братьев в лаборатории заключается в том, что кДНК системы 20 мкл, полученная каждой инверсией, разводится непосредственно в 20 раз, в то время как сестры, получившие докторскую степень, разбавляются в 10 раз.Обычно я завишу от ситуации.Поскольку качество РНК, упомянутое каждым человеком, разное, уровень реверсии также разный, и технология реверсии может быть нестабильной.
Поэтому каждый раз, когда я получаю обращенную кДНК, я сначала разбавляю ее примерно в 3 раза, а затем использую ген домашнего хозяйства для проведения ОТ-ПЦР, количество циклов обычно составляет 25 циклов, чтобы определить конкретную концентрацию, а затем определить окончательный фактор разведения.
3 Вы уверены, что ваши праймеры просты в использовании?
Он может пройти кривую плавления qRT-PCR, но это все равно стоит денег.Для лабораторий без больших денег, когда они получают много праймеров, они могут использовать обычную ОТ-ПЦР, чтобы увидеть, является ли это одной полосой, и определить специфичность праймеров.Если у лаборатории есть деньги, специфичность всех праймеров можно определить один раз по кривой плавления.
4 Вы уверены, что ваши экспериментальные условия подходят?
SYBR следует защищать от сильного света, поэтому при добавлении реагента SYBR старайтесь выключать верхний свет, а для его завершения необходимо использовать только тусклый свет.
Хранить SYBR при 4°C.Во время использования осторожно переворачивайте вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать, чтобы избежать пенообразования, и не энергично встряхивайте.
Некоторые младшие сестры любят делать отметки на доске для ПЦР, опасаясь перепутать образцы, что неправильно.Поскольку ваши маркеры, скорее всего, повлияют на сбор флуоресцентных сигналов, я обычно рекомендую младшим школьникам использовать экспериментальные тетради для улучшения памяти, как показано ниже.
Фигура.Диаграмма загрузки образца qRT-PCR
5 Вы уверены, что делаете это правильно?
Обязательно наденьте перчатки, наденьте перчатки, наденьте перчатки и трижды произнесите важные вещи.
Чтобы уменьшить экспозицию SYBR к свету, лично мне нравится сначала добавлять шаблон, как показано на рисунке ниже.Согласно опыту, добавление небольшого количества шаблона может привести к ошибкам выборки.Поэтому, чтобы свести к минимуму ошибку, вызванную добавлением небольшого количества шаблона, я обычно снова удваиваю образец и удваиваю количество при добавлении образца, чтобы уменьшить количество добавляемой H2O2.
Фигура.Схематическая диаграмма загрузки qRT-PCR
Затем настройте систему qRT-PCR следующим образом.
Фигура.Схема подготовки системы qRT-PCR
ПРИМЕЧАНИЕ. Процесс настройки необходимо выполнять на льду.
После добавления образца наклейте прозрачную герметизирующую пленку.Старайтесь не прикасаться руками к поверхности прозрачной запечатывающей пленки, действуйте только из пространства по обеим сторонам пленки.Потому что отпечатки пальцев также могут влиять на сбор флуоресцентных сигналов.Затем используйте центрифугу для быстрого центрифугирования в течение 10 с на низкой скорости, чтобы предотвратить зависание образца на стене.
Сопутствующие товары:
Время публикации: 28 апреля 2023 г.
