RT-qPCR — это базовый эксперимент молекулярной биологии, и каждый должен с ним ознакомиться.В основном он включает три этапа: извлечение РНК, обратную транскрипцию в кДНК и количественную флуоресцентную ПЦР в реальном времени.Не помогает, что происходит?Скорее всего проблема вэксперимент с обратной транскрипцией!Хотя кажется, что в эксперименте по обратной транскрипции нужно добавить только РНК, dNTP, праймеры иобратная транскриптазав центрифужную пробирку и хорошо перемешайте, но в реальном рабочем процессе все еще есть много деталей, на которые необходимо обратить внимание.Давайте узнаем об этом!

Как судить о качестве РНК?
Для получения кДНК качество РНК имеет решающее значение!Качество РНК можно определить в основном по двум аспектам:
(1) целостность РНК:Целостность РНК можно проверить с помощью электрофореза в агарозном геле.. Взяв в качестве примера эукариот, полная тотальная РНК имеет три четкие полосы, молекулярные массы от больших к малым составляют 28S, 18S и 5S, причем 28S в два раза ярче 18S;если видны три полосы, но тип полосы размыт или Диффузия означает, что РНК частично деградировала.В это время, пожалуйста, немедленно выполните реакцию обратной транскрипции и соответствующим образом увеличьте ввод шаблона;если видна только полоса с небольшой молекулярной массой или полоса отсутствует, РНК полностью деградировала и ее необходимо повторно экстрагировать.Agilent 2100 показывает целостность РНК с помощью диаграммы пиков и значения RIN.Если нуклеиновая кислота цела, базовая линия электрофореграммы плоская;если нуклеиновая кислота сильно расщеплена, исходный уровень неравномерен и появляется больше пиков деградации;значение RIN отражает целостность РНК, в диапазоне от 0 до 10, чем больше значение, тем лучше качество РНК.Ну и чем выше степень полноты.
(2) Чистота РНК:Соотношение OD260/280 можно определить с помощью УФ-спектрофотометрии.Если соотношение OD260/280 составляет от 1,9 до 2,1, чистота очень хорошая.
Остаточная геномная ДНК может привести к неточным количественным результатам.
Когда РНК экстрагируется, полученная РНК может быть смешана с геномной ДНК (гДНК), которая не была очищена.Следовательно, кДНК после обратной транскрипции также будет смешиваться сгДНК.Во время нижнего течениякПЦРреакция,кДНКи гДНК могут амплифицироваться одновременно, что приводит к относительно небольшому значению CT, поэтому результаты могут быть необъективными.
Так что же нам делать в этой ситуации?Форегенепредлагает:
(1) выполнить очистку генома на обращенной РНК, которую можно удалить путем экстракции колонки во время экстракции РНК;
(2) Обработайте выделенную РНК ДНКазой.I , но остановите его с помощью ЭДТА;
реагентов обратной транскрипциис модулями очистки генома;

Как выбрать праймеры для обратной транскрипции?
Праймеры обратной транскрипции также влияют на исход реакции обратной транскрипции.Вы можете выбрать случайные праймеры, Oligo dT или ген-специфические праймеры для обратной транскрипции в соответствии с конкретными обстоятельствами эксперимента:
(1) Конкретные стенограммы: рекомендуются геноспецифические праймеры;
(2) Транскрипты длинных фрагментов: рекомендуются олиго-dT/ген-специфичные праймеры;
(3) Внутренние фрагменты длинных сегментов транскриптов: геноспецифические праймеры/случайные праймеры/случайные праймеры + Oligo dT.Если последующий эксперимент qPCR проводится, Oligo dT нельзя использовать отдельно, потому что использование только Oligo dT может привести к смещению 3'-конца, что приведет к неточным результатам эксперимента qPCR;
(4) микроРНК: Можно использовать праймеры «стебель-петля» или хвостовые праймеры.

Во сколько раз следует развести кДНК продукта обратной транскрипции для количественного определения?
После получения кДНК продукта обратной транскрипции очень важно, во сколько раз следует развести кДНК для экспериментов с количественной ПЦР.Если концентрация кДНК слишком высока или слишком низка, это может повлиять на эффективность амплификации.Можно ли измерить концентрацию кДНК и как это сделать?
(1) Концентрация кДНК продукта обратной транскрипции не может быть измерена, потому что в дополнение к продукту кДНК продукт обратной транскрипции также содержит остаточный буфер обратной транскрипции, обратную транскриптазу, праймеры и т. д., которые будут мешать результатам измерения концентрации и вызывать аномальное соотношение OD260/280, OD260/230 и, следовательно, не отражать истинный выход кДНК.В это время, скажут некоторые друзья, тогда я измерю концентрацию после очистки;Здесь Foregene напоминает, что кДНК не рекомендуется очищать, поскольку длина кДНК, полученная реверсированием, различна, и короткая кДНК будет потеряна при очистке.
(2) Так что же делать?Перед экспериментом qPCR можно определить градиент разведения кДНК в ходе предварительного эксперимента.Например: используйте исходный раствор кДНК, 10-кратное разведение и 100-кратное разведение в качестве шаблонов для экспериментов qPCR и выберите коэффициент разбавления со значением CT в диапазоне 18-28.

Как микроРНК должны подвергаться обратной транскрипции?
miRNA представляет собой одноцепочечную малую молекулу РНК размером около 22 нуклеотидов, которая не кодирует белок.Из-за его короткой длины обычным методом количественной ПЦР трудно определить его количество напрямую, поэтому часто необходимо удлинять микроРНК;обычно используемые методы обратной транскрипции для микроРНК включают метод стволовой петли и метод хвоста.
Метод «стебель-петля» заключается в удлинении микроРНК путем добавления праймеров «стебель-петля».Этот метод обнаружения имеет более высокую чувствительность и специфичность, но пропускная способность обнаружения низкая.Одна обратная транскрипция может обнаружить только одну микроРНК и внутреннюю ссылку;метод добавления хвоста состоит из двух. Он завершается совместным действием двух ферментов, которые представляют собой ПолиА-полимеразу и обратную транскриптазу.ПолиА-полимераза отвечает за добавление полиА-хвостов к микроРНК для увеличения ее длины, а обратная транскриптаза выполняет реакцию обратной транскрипции.Этот метод имеет высокую пропускную способность обнаружения и может обнаруживать несколько miRNAs и внутренних ссылок в одной обратной транскрипции, но чувствительность и специфичность метода «стебель-петля» низки.