ПЦР в реальном времени, также известная как количественная ПЦР или кПЦР, представляет собой метод мониторинга и анализа продуктов амплификации ПЦР в реальном времени.
Поскольку количественная ПЦР имеет преимущества простой операции, быстрой и удобной, высокой чувствительности, хорошей воспроизводимости и низкой степени загрязнения, она широко используется в медицинских тестах, оценке эффективности лекарств, исследованиях экспрессии генов, трансгенных исследованиях, обнаружении генов, обнаружении патогенов, обнаружении животных и растений., испытание еды и другие поля.
Поэтому, занимаетесь ли вы фундаментальными исследованиями в области наук о жизни, или работники фармацевтических компаний, животноводческих предприятий, предприятий пищевой промышленности, или даже работники входно-выходных контрольно-карантинных бюро, отделов экологического мониторинга, больниц и других подразделений, вы будете более или менее подвержены или вам необходимо знать знания по освоению количественной ПЦР.

Принцип ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени — это метод, при котором флуоресцентные вещества добавляются в реакционную систему ПЦР, а интенсивность сигнала флуоресценции в процессе реакции ПЦР отслеживается в режиме реального времени с помощью прибора для количественной ПЦР, и, наконец, экспериментальные данные анализируются и обрабатываются.

【Кривая усиления】– кривая, описывающая динамический процесс ПЦР.Кривая амплификации ПЦР на самом деле представляет собой не стандартную экспоненциальную кривую, а сигмовидную кривую.

[Фаза платформы кривой усиления]С увеличением количества циклов ПЦР, инактивацией ДНК-полимеразы, истощением dNTP и праймеров, ингибированием реакции синтеза побочным продуктом реакции пирофосфатом и т. д. ПЦР не всегда экспоненциально расширяется., и в конечном итоге выйдет на плато.

[Область экспоненциального роста кривой усиления]Хотя фаза плато сильно различается, в определенной области области экспоненциального роста кривой амплификации повторяемость очень хорошая, что очень важно для количественного анализа ПЦР.

[Пороговое значение и значение Ct]Мы устанавливаем предельное значение обнаружения флуоресценции в соответствующем положении в области экспоненциального роста кривой усиления, а именно пороговое значение (Threshold).Пересечение порогового значения и кривой усиления представляет собой значение Ct, то есть значение Ct относится к количеству циклов (пороговый цикл), когда достигается пороговое значение.

На приведенном ниже графике четко показана взаимосвязь между пороговой линией и кривой усиления, порогом и значением Ct.

【Как количественно оценить?】

Математической теорией доказано, что величина Ct имеет обратную линейную зависимость от логарифма числа исходных шаблонов.ПЦР в реальном времени отслеживает продукты амплификации ПЦР в реальном времени и определяет их количество во время фазы экспоненциальной амплификации.

Для каждого цикла ПЦР ДНК увеличивалась экспоненциально в 2 раза и вскоре достигала плато.

Предполагая, что количество исходной ДНК равно A₀ , после n циклов теоретическое количество продукта ДНК может быть выражено как:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Тогда, чем больше начальное количество ДНК A 0 , тем раньше количество амплифицированного продукта достигнет значения обнаружения An , а число циклов при достижении An будет значением Ct.То есть, чем больше начальное количество ДНК A 0 , тем раньше достигается пик кривой амплификации и, соответственно, меньше необходимое количество циклов n.

Мы проводим градиентное разведение стандарта известной концентрации и используем его в качестве шаблона для ПЦР в реальном времени, и через равные промежутки времени будет получена серия кривых амплификации в порядке исходного количества ДНК от большего к меньшему.Согласно линейной зависимости между значением Ct и логарифмом числа стартовых шаблонов,[стандартная кривая] может быть создана.

Подставив значение Ct образца с неизвестной концентрацией на стандартную кривую, можно получить начальное количество матрицы образца с неизвестной концентрацией, что является количественным принципом ПЦР в реальном времени.

Метод обнаружения ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени обнаруживает продукты амплификации ПЦР путем определения интенсивности флуоресценции в реакционной системе.

Принцип метода заливки флуоресцентного красителя】

Флуоресцентные красители, такие как TB Green ® , могут неспецифически связываться с двухцепочечной ДНК в системах ПЦР и флуоресцировать при связывании.

Интенсивность флуоресценции в реакционной системе увеличивалась экспоненциально с увеличением количества циклов ПЦР.Определяя интенсивность флуоресценции, количество амплификации ДНК в реакционной системе можно отслеживать в режиме реального времени, а затем можно обратно оценить количество исходной матрицы в образце.

【Принцип метода флуоресцентного зонда】

флуоресцентный зондпредставляет собой последовательность нуклеиновой кислоты с флуоресцентной группой на 5'-конце и гасящей группой на 3'-конце, которая может специфически связываться с матрицей.Когда зонд не поврежден, флуоресценция, испускаемая флуорофором, гасится гасящей группой и не может флуоресцировать.Когда зонд разлагается, флуоресцентное вещество диссоциирует и излучает флуоресценцию.

Флуоресцентный зонд добавляют к реакционному раствору для ПЦР.В процессе отжига флуоресцентный зонд будет связываться с определенным положением матрицы.В процессе удлинения экзонуклеазная активность 5'→3' фермента ПЦР может разлагать флуоресцентный зонд, гибридизованный с матрицей, и флуоресцентное вещество диссоциирует с испусканием флуоресценции.Определяя интенсивность флуоресценции зонда в реакционной системе, можно достичь цели мониторинга количества амплификации продукта ПЦР.

【Выбор метода обнаружения флуоресценции】

Если он используется для различения последовательностей с высокой гомологией и проведения мультиплексной ПЦР-детекции, такой как анализ типирования SNP, метод флуоресцентного зонда незаменим.
Для других экспериментов ПЦР в реальном времени можно использовать простой, легкий и недорогой метод флуоресцентной химеры.

зондыСильная специфичность, способная к мультиплексной ПЦР

недостаток

Высокие требования к специфичности амплификации;

мультиплексная ПЦР не может быть выполнена Необходимость разработки специальных зондов, высокая стоимость;

иногда конструкция зонда сложна

Сопутствующие товары: