В экспериментах qPCR дизайн праймера также является очень важным звеном.Подходят ли праймеры или нет, тесно связано с тем, достигает ли эффективность амплификации стандарта, являются ли продукты амплификации специфичными и доступны ли экспериментальные результаты.
Итак, как улучшить специфичность праймеров для КПЦР?Высокая эффективность усиления?
Сегодня мы вместе с вами разработаем праймеры для количественной ПЦР, и пусть разработка праймеров для количественной ПЦР станет эффективным навыком в экспериментах.
При конструировании праймеров для кПЦР обычно обращают внимание на следующие моменты: праймеры должны максимально пересекаться с интронами, длина продукта должна составлять 100-300 п.н., значение Tm должно быть как можно ближе к 60°C, а верхний и нижний праймеры должны быть как можно ближе друг к другу, а конец праймера должен быть G или C и т. д. ждать.
1. Дизайн праймеров, охватывающих интроны
При разработке праймеров для кПЦР выбор праймеров, разработанных для интронов, может предотвратить амплификацию матрицы гДНК, а все продукты получены в результате амплификации кДНК, что устраняет влияние загрязнения гДНК.
2. Длина грунтовки
Длина праймера обычно составляет 18-30 нуклеотидов, а длину продукта амплификации следует контролировать в пределах 100-300 п.н., насколько это возможно.
Если праймер слишком короткий, это приведет к неспецифической амплификации, а если он слишком длинный, он легко образует вторичную структуру (например, структуру шпильки).Если продукт амплификации слишком длинный, он не подходит для реакции полимеразы, что повлияет на эффективность амплификации ПЦР.
3. Содержание GC и значение Tm
Содержание GC в праймерах должно находиться в диапазоне от 40% до 60%.Если он слишком высок или слишком низок, это не способствует инициированию реакции.Содержание GC прямого и обратного праймеров должно быть близким для того, чтобы получить одинаковое значение Tm и температуру отжига.
Значение Tm должно быть в пределах 55-65°C, как правило, около 60°C, а значение Tm выше и ниже по потоку должно быть как можно ближе, предпочтительно не более 4°C.
4. Избегайте выбора A на 3'-конце праймера.
Когда 3'-конец праймера не совпадает, существуют большие различия в эффективности синтеза разных оснований.Когда последним основанием является А, оно также может инициировать синтез цепи даже в случае несоответствия, а когда последним основанием является Т, когда эффективность индукции несоответствия сильно снижается.Поэтому старайтесь избегать выбора А на 3'-конце праймера, а лучше выбрать Т.
Если это праймер зонда, 5'-конец зонда не может быть G, потому что даже когда одно основание G соединено с флуоресцентной репортерной группой FAM, G также может гасить флуоресцентный сигнал, испускаемый группой FAM, что приводит к ложноотрицательным результатам.Появляться.
5. Базовый дистрибутив
Распределение четырех оснований в праймере предпочтительно является случайным, избегая более 3 последовательных G или C на 3'-конце и более 3 последовательныхG или C легко генерировать спаривание в области последовательности, богатой GC.
6. Область дизайна грунтовки должна избегать сложных вторичных структур.
Вторичная структура, образованная одной цепью продукта амплификации, будет влиять на плавный ход ПЦР.Предсказывая заранее наличие вторичной структуры в последовательности-мишени, старайтесь избегать этой области при разработке праймеров.
7. Сами праймеры и между праймерами следует избегать последовательных комплементарных оснований.
Между самим праймером и праймером не может быть последовательной комплементарности из 4 оснований.Сам праймер не должен иметь комплементарной последовательности, в противном случае он будет складываться, образуя структуру шпильки, что повлияет на комбинацию отжига праймера и матрицы.
Комплементарные последовательности не могут существовать между восходящими и нисходящими праймерами.Комплементарность между праймерами приведет к образованию димеров праймеров, что снизит эффективность ПЦР и даже повлияет на количественную точность.Если структуры праймер-димер и шпилька неизбежны, значение △G не должно быть слишком высоким (должно быть меньше 4,5 ккал/моль).
8. Праймеры амплифицируют целевой специфический продукт.
Конечная цель обнаружения КПЦР состоит в том, чтобы понять обилие целевого гена.Если происходит неспецифическая амплификация, количественная оценка будет неточной.Поэтому после того, как праймеры разработаны, их необходимо протестировать с помощью BLAST, а специфичность продуктов сравнить в базе данных последовательностей.
Затем мы берем человеческий ген GAS6 (специфический для остановки роста 6) в качестве примера для разработки праймеров для количественной ПЦР.
01 ген запроса
Гомо GAS6через НКБИ.Здесь мы должны обратить внимание на сравнение названия гена и вида, чтобы убедиться, что они непротиворечивы.
02 Найдите последовательность генов
(1) Если целевой последовательностью является геномная ДНК, выберите первую, которая представляет собой последовательность геномной ДНК гена.
(2) Если целевой последовательностью является мРНК, выберите вторую.После ввода нажмите «CDS» в таблице ниже.Коричневая фоновая последовательность является кодирующей последовательностью гена.
03 Грунтовки для дизайна
Войдите в интерфейс Primer-BLAST
Введите порядковый номер гена или последовательность в формате Fasta в левом верхнем углу и заполните соответствующие параметры.

Нажмите «Получить праймеры», и появится всплывающее окно NCBI, чтобы сообщить вам, что такой выбор параметров будет усилен для других вариантов сплайсинга.Мы можем проверить различные варианты сплайсинга и отправить их, чтобы получить соответствующую пару праймеров (как показано на рисунке ниже).Этот процесс может занять десятки секунд.
Температура отжига этих пар праймеров составляет около 60°C.В соответствии с целью эксперимента выберите праймеры с умеренной длиной, хорошей специфичностью и меньшим количеством самокомплементации праймеров для эксперимента, и вероятность успеха будет достаточно высока!
04Верификация специфичности праймера
На самом деле, помимо разработки праймеров, Primer-Blast также может оценивать праймеры, которые мы разработали сами.Вернитесь на страницу дизайна праймера, введите разработанные нами восходящий и нисходящий праймеры, и другие параметры не будут изменены.После отправки вы можете увидеть, существует ли пара праймеров для других генов.Если все они отображаются на гене, который мы хотим амплифицировать, это означает, что специфичность этой пары праймеров велика!(Например, это единственный результат запроса праймера!)

05 Оценка качества грунтовки
Какой праймер является «идеальным» праймером, который сочетает в себе «стандартную эффективность амплификации», «улучшенные характеристики продукта» и «надежные экспериментальные результаты»?
Эффективность усиления

кривая плавления
Эффективность амплификации праймеров достигает 90%-110%, что означает хорошую эффективность амплификации, а кривая плавления имеет один пик и обычно Tm>80°C, что означает хорошую специфичность амплификации.
 
Сопутствующие товары:
ПЦР в реальном времени Easy–SYBR GREEN I
ПЦР в реальном времени Easy-Taqman