РНКаза — деликатное слово, которое не хотят слышать многие студенты, часто проводящие эксперименты по извлечению РНК.Полностью вооружившись, РНК, которая была окончательно выделена высокотоксичными реагентами фенолом и хлороформом, подверглась деградации.Я не мирюсь!!!Сегодня давайте взглянем на происхождение знаменитого Rnase.

Рибонуклеаза (РНКаза) или РНКаза — это нуклеаза, которая может гидролизовать РНК на небольшие молекулы.РНКаза, как низкомолекулярный белок, необычайно стабильна. .Обычная стерилизация паром при высокой температуре и высоком давлении, а также белковые ингибиторы не могут полностью его инактивировать.Стабильность РНКазы в основном обусловлена ​​дисульфидными связями в структуре.Например, обычно используемая РНКаза бычьей поджелудочной железы имеет только 124 аминокислоты, но содержит 4 дисульфидные связи.Серная связь и дисульфидная связь придают РНКазе превосходную термическую стабильность.Кроме того, РНКаза имеет относительно небольшую молекулярную массу и во многих случаях может быстро восстанавливать исходную конформацию.

Помимо исключительной стабильности,РНКазы широко распространены в лаборатории. .РНКаза представляет собой биологический защитный механизм.Для клетки экзогенная РНК часто оказывается фатальной.По сравнению с экзогенной ДНК экзогенная РНК часто более опасна.РНК успешно транскрибируется и транслируется, поэтому почти все организмы выработали РНКазы для защиты от вторжения экзогенной РНК.Поэтому бактериальные клетки, выращенные в лаборатории, и те, кто выделяет РНК, источают аромат РНКазы.Жидкости человеческого организма (слюна, слезы и т. д.) содержат большое количество РНКазы, поэтому не стоит плакать, когда РНК разрушается.Чем больше вы плачете, тем хуже деградация РНК!!Сестра Дайю не подходит для выделения РНК!

Кроме того, ваша нежная кожа также содержит много РНКазы, а маркеры, пипетки, дверцы холодильника и дверные ручки, к которым прикасалась кожа, также содержат РНКазу.

После стольких бессвязных разговоров давайте посмотрим, как бороться с РНКазами.

Первое, о чем все думают, удаляя РНК, этоDEPC(диэтилпирокарбонат).DEPC в основном денатурирует белок, соединяясь с имидазольным кольцом гистидина активной группы РНКазы, тем самым ингибируя активность фермента.0,1% DEPC может иметь лучший эффект удаления РНКазы, но мы должны обратить внимание на то, что DEPC является известным канцерогеном, поэтому при его использовании следует уделять особое внимание.

Что касается РНКазы, нам нужно начать с двух аспектов:во-первых, ингибировать активность эндогенной РНКазы

Обычные реагенты для выделения РНК, такие как изотиоцианат гуанидина и DTT, содержащиеся в Trizol, могут открывать дисульфидную связь РНКазы, но некоторые РНКазы все еще присутствуют, особенно в образцах тканей, поэтому обратите внимание на низкую температуру.

1.Немедленно погрузите образец ткани в жидкий азот после его извлечения или в коммерческий раствор для сохранения РНК.

2.После извлечения РНК из клеточного образца добавьте его в раствор для лизиса и лизируйте в холодильнике.

3. Для шлифовки лучше всего использовать жидкий азот при гомогенизации образцов ткани.При использовании электрического гомогенизатора без жидкого азота обратите внимание на полное предварительное охлаждение адаптера гомогената.

Второй – экзогенная ДНКаза.

1.Будьте во всеоружии, наденьте лабораторный халат, наденьте маску и обязательно наденьте пару новых перчаток (не будьте так бережливы!! Следует отметить, что тризол является суперкоррозийным, и он также очень силен через перчатки, поэтому не капайте на руки).

2.Все используемые наконечники для пипеток, пробирки для ЭП, пробирки для ПЦР и другое оборудование должны быть обработаны деРНКазой.Его можно пропитать 0,1% DEPC, а затем сжать под высоким давлением.Обратите внимание на работу в вытяжном шкафу.Местные тираны могут напрямую покупать расходные материалы для удаления ферментов.

PS: Позвольте мне рассказать вам ленивый метод.Хотя высокая температура и высокое давление не могут полностью удалить РНКазу, они удалят большую ее часть.2 раза высокая температура и высокое давление оказывают хороший эффект, а извлечение РНК малоэффективно.

3.Алкоголь может денатурировать белки,так что стол для выделения РНК можно протирать 75% спиртом , а перчатки тоже можно сбрызнуть спиртом.

4.Конечный раствор для растворения РНК и центрифужная пробирка также должны быть обработаны деРНКазой.Вода DEPC является широко используемым раствором для растворения РНК.Поговорим о правильном способе приготовления воды DEPC (не забудьте переупаковать коммерческую воду DEPC при покупке).

Добавьте DEPC в сверхчистую воду в соотношении 1:1000, хорошо встряхните, оставьте на ночь при 37°C и стерилизуйте при 121°C при высокой температуре и высоком давлении в течение 15 минут.Вода DEPC может храниться при температуре -20°C в аликвотах по 1 мл.

Наконец, резюмируя: низкая температура - это ключ, расходные материалы хорошо обрабатываются, во всеоружии и меньше болтовни!

Ну вот и все, что касается сегодняшней стратегии.Желаю всем упомянутой вами концентрации и чистоты РНК.Оба A260/A280 2.0!!!

Конечно, если вы используетенабор для выделения РНК при комнатной температуре, вы можете не столкнуться с вышеуказанными проблемами.

При работе при комнатной температуре без добавления ДНКазы полная РНК извлекается из клеток за 11 минут, а общая РНК извлекается из тканей животных или растений за 30 минут.

За пробными образцами обращайтесь:overseas@foregene.com

Сопутствующие товары:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/