• ПЦР — это метод, используемый для амплификации ДНК из небольшого количества ДНК-матрицы.RT-PCR использует обратную транскрипцию для создания матрицы ДНК из источника РНК, которую затем можно амплифицировать.
• ПЦР и ОТ-ПЦР обычно являются реакциями конечной точки, тогда как кПЦР и ОТ-кПЦР используют кинетику скорости синтеза продукта во время реакции ПЦР для количественного определения количества присутствующей матрицы.
• Новые методы, такие как цифровая ПЦР, обеспечивают абсолютное количественное определение исходной матрицы ДНК, в то время как такие методы, как изотермическая ПЦР, снижают потребность в дорогостоящем оборудовании для получения надежных результатов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — относительно простой и широко используемый метод молекулярной биологии для амплификации и обнаружения последовательностей ДНК и РНК.По сравнению с традиционными методами клонирования и амплификации ДНК, которые часто могут занимать несколько дней, для ПЦР требуется всего несколько часов.ПЦР очень чувствительна и требует минимального количества шаблонов для обнаружения и амплификации специфических последовательностей.Базовые методы ПЦР продвинулись дальше простого обнаружения ДНК и РНК.Ниже мы представили обзор различных методов ПЦР и реагентов, которые мы предоставляем в Enzo Life Sciences для ваших исследовательских нужд.Мы стремимся помочь ученым быстро получить доступ к реагентам ПЦР для использования в их следующем исследовательском проекте!

ПЦР

Для стандартной ПЦР все, что вам нужно, — это ДНК-полимераза, магний, нуклеотиды, праймеры, матрица ДНК для амплификации и термоциклер.Механизм ПЦР так же прост, как и ее цель: 1) двухцепочечная ДНК (дцДНК) подвергается тепловой денатурации, 2) праймеры выравниваются по одиночным нитям ДНК и 3) праймеры удлиняются ДНК-полимеразой, в результате чего образуются две копии исходная цепь ДНК.Процесс денатурации, отжига и элонгации в ряде температур и времен известен как один цикл амплификации (рис. 1).

Каждый этап цикла должен быть оптимизирован для используемого шаблона и набора праймеров.Этот цикл повторяется примерно 20-40 раз, а затем амплифицированный продукт можно проанализировать, обычно с помощью агарозного геля (рис. 2).

Поскольку ПЦР является высокочувствительным методом и для отдельных реакций требуются очень небольшие объемы, рекомендуется готовить мастер-микс для нескольких реакций.Мастер-микс необходимо хорошо перемешать, а затем разделить по количеству реакций, гарантируя, что каждая реакция будет содержать одинаковое количество фермента, dNTP и праймеров.Многие поставщики, такие как Enzo Life Sciences, также предлагают смеси для ПЦР, которые уже содержат все, кроме праймеров и матрицы ДНК.

Области, богатые гуанином/цитозином (GC-богатые), представляют собой проблему для стандартных методов ПЦР.Последовательности, богатые GC, более стабильны, чем последовательности с более низким содержанием GC.Более того, последовательности, богатые GC, имеют тенденцию образовывать вторичные структуры, такие как шпильки.В результате двойные цепи, богатые GC, трудно полностью разделить во время фазы денатурации.Следовательно, ДНК-полимераза не может беспрепятственно синтезировать новую цепь.Более высокая температура денатурации может улучшить это, а корректировка в сторону более высокой температуры отжига и более короткого времени отжига может предотвратить неспецифическое связывание праймеров, богатых GC.Дополнительные реагенты могут усилить амплификацию последовательностей, богатых GC.ДМСО, глицерин и бетаин помогают разрушить вторичные структуры, возникающие в результате взаимодействий GC, и тем самым облегчают разделение двойных цепей.

ПЦР с горячим стартом

Неспецифическая амплификация — проблема, которая может возникнуть во время ПЦР.Большинство ДНК-полимераз, используемых для ПЦР, лучше всего работают при температуре от 68°C до 72°C.Однако фермент может быть активен и при более низких температурах, хотя и в меньшей степени.При температурах намного ниже температуры отжига праймеры могут связываться неспецифически и приводить к неспецифической амплификации, даже если реакция проводится на льду.Этого можно предотвратить, используя ингибиторы полимеразы, которые диссоциируют от ДНК-полимеразы только при достижении определенной температуры, отсюда и термин «ПЦР с горячим стартом».Ингибитор может представлять собой антитело, которое связывает полимеразу и денатурирует при начальной температуре денатурации (обычно 95°C).

Высококачественная полимераза

Хотя ДНК-полимеразы довольно точно амплифицируются до исходной матричной последовательности, могут возникать ошибки в сопоставлении нуклеотидов.Несоответствия в таких приложениях, как клонирование, могут привести к усечению транскриптов, а также к неправильной трансляции или неактивности последующих белков.Чтобы избежать этих несоответствий, были идентифицированы и включены в рабочий процесс полимеразы с «корректорской» активностью.Первая корректирующая полимераза Pfu была идентифицирована в 1991 году у Pyrococcus Furiosus.Этот фермент Pfu обладает экзонуклеазной активностью от 3' до 5'.По мере амплификации ДНК экзонуклеаза удаляет несовпадающие нуклеотиды на 3'-конце цепи.Затем правильный нуклеотид заменяется, и синтез ДНК продолжается.Идентификация неправильных нуклеотидных последовательностей основана на сродстве связывания правильного нуклеозидтрифосфата с ферментом, при этом неэффективное связывание замедляет синтез и позволяет осуществить правильную замену.Корректирующая активность полимеразы Pfu приводит к меньшему количеству ошибок в конечной последовательности по сравнению с ДНК-полимеразой Taq.В последние годы были идентифицированы другие ферменты корректуры, а также были внесены модификации исходного фермента Pfu для дальнейшего снижения частоты ошибок во время амплификации ДНК.

ОТ-ПЦР

ПЦР с обратной транскрипцией или ОТ-ПЦР позволяет использовать РНК в качестве матрицы.Дополнительный шаг позволяет обнаружить и амплифицировать РНК.РНК подвергается обратной транскрипции в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы.Качество и чистота матрицы РНК имеют важное значение для успеха RT-PCR.Первым этапом RT-PCR является синтез гибрида ДНК/РНК.Обратная транскриптаза также выполняет функцию РНКазы H, которая разрушает часть РНК гибрида.Затем одноцепочечная молекула ДНК дополняется ДНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью обратной транскриптазы в кДНК.Эффективность реакции первой цепи может повлиять на процесс амплификации.С этого момента для амплификации кДНК используется стандартная процедура ПЦР.Возможность превратить РНК в кДНК с помощью RT-PCR имеет много преимуществ и в основном используется для анализа экспрессии генов.РНК одноцепочечная и очень нестабильная, что усложняет работу с ней.Обычно он служит первым шагом в qPCR, который количественно определяет транскрипты РНК в биологическом образце.

qPCR и RT-qPCR

Количественная ПЦР (кПЦР) используется для обнаружения, характеристики и количественного определения нуклеиновых кислот во многих приложениях.При RT-qPCR транскрипты РНК часто оцениваются путем сначала обратной транскрипции их в кДНК, как описано выше, а затем впоследствии проводится qPCR.Как и в стандартной ПЦР, ДНК амплифицируется в три повторяющихся этапа: денатурация, отжиг и элонгация.Однако в кПЦР флуоресцентная маркировка позволяет собирать данные по ходу ПЦР.Этот метод имеет много преимуществ из-за разнообразия доступных методов и химических веществ.

В кПЦР на основе красителей (обычно зеленого цвета) флуоресцентная маркировка позволяет количественно оценить амплифицированные молекулы ДНК с помощью красителя, связывающего дцДНК.Во время каждого цикла измеряют флуоресценцию.Сигнал флуоресценции увеличивается пропорционально количеству реплицируемой ДНК.Следовательно, ДНК количественно оценивается в «реальном времени» (рис. 3).Недостатком кПЦР на основе красителя является то, что одновременно можно исследовать только одну мишень и что краситель будет связываться с любой дц-ДНК, присутствующей в образце.

При кПЦР на основе зондов в каждом образце одновременно можно обнаружить множество мишеней, но это требует оптимизации и разработки специфичных для мишеней зондов, используемых в дополнение к праймерам.Доступно несколько типов конструкций зондов, но наиболее распространенным типом является зонд гидролиза, который включает в себя флуорофор и тушитель.Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) предотвращает излучение флуорофора через тушитель, пока зонд не поврежден.Однако во время реакции ПЦР зонд гидролизуется во время удлинения праймера и амплификации специфической последовательности, с которой он связан.Расщепление зонда отделяет флуорофор от тушителя и приводит к зависимому от амплификации увеличению флуоресценции (рис. 4).Таким образом, сигнал флуоресценции в реакции qPCR на основе зонда пропорционален количеству целевой последовательности зонда, присутствующей в образце.Поскольку кПЦР на основе зонда более специфична, чем кПЦР на основе красителей, эта технология часто используется в диагностических анализах на основе кПЦР.

Изотермическое усиление

Упомянутые выше методы ПЦР требуют дорогостоящего термоциклического оборудования для точного повышения и понижения температуры в камере на этапах денатурации, отжига и удлинения.Был разработан ряд методов, которые не требуют таких точных устройств и могут быть реализованы на простой водяной бане или даже внутри интересующих клеток.Эти методы вместе называются изотермическим усилением и работают на основе экспоненциального, линейного или каскадного усиления.

Самый известный тип изотермической амплификации — это петлевая изотермическая амплификация, или LAMP.LAMP использует экспоненциальную амплификацию при 65⁰C для амплификации матричной ДНК или РНК.При выполнении LAMP четыре-шесть праймеров, комплементарных участкам целевой ДНК, используются с ДНК-полимеразой для синтеза новой ДНК.Два из этих праймеров имеют комплементарные последовательности, которые распознают последовательности в других праймерах и связывают их, позволяя сформировать «петлеобразную» структуру во вновь синтезированной ДНК, которая затем способствует отжигу праймеров в последующих раундах амплификации.LAMP можно визуализировать несколькими методами, включая флуоресценцию, электрофорез в агарозном геле или колориметрию.Простота визуализации и обнаружения присутствия или отсутствия продукта с помощью колориметрии, а также отсутствие необходимого дорогостоящего оборудования сделали LAMP подходящим вариантом для тестирования SARS-CoV-2 в районах, где клинические лабораторные исследования были недоступны, а также для хранения и транспортировки образцов. было невозможно, или в лабораториях, у которых ранее не было оборудования для термоциклирования ПЦР.