Советы по улучшению восстановления клея

1. Увеличьте нагрузку образца во время электрофореза.

2. Используйте свежеприготовленный буфер для электрофореза.

3. При резке клея старайтесь резать только клей полосками, чтобы уменьшить объем резки клея: не нужен клей с небольшим количеством целевых фрагментов, иначе это повлияет на скорость восстановления.

4. После расплавления двух или более кусочков клея используйте тюбик любого объема и перенесите его в ту же колонку.

5. Раствор, добавляемый в золь, может быть немного больше, что более способствует связыванию ДНК с мембраной, но обычно не превышает 750 мкл.

6. Ключом к восстановлению геля является связывание ДНК с колонкой за счет концентрации соли, кислотности (заряда) и гидрофобности раствора в колонке.Поэтому, если pH буфера для электрофореза слишком высок, к золю можно добавить 10 мкл (pH 5,0, 3 моль/л NaAC);для лучшего перехвата молекул ДНК на мембране в жидкость после растворения клея можно добавить для нагревания 30% изопропанол.

7. Перед добавлением элюента оставьте колонку при комнатной температуре на несколько минут (около 10 минут) для полного испарения этанола.

8. Наконец, добавьте меньше элюента, чтобы свести к минимуму извлекаемый объем.Обычно для элюирования используют 30-50 мкл элюента (не слишком мало, иначе он не сможет смочить мембрану, что не способствует элюированию);капли элюции находятся в центре мембраны, чтобы полностью элюировать ДНК, связанную с мембраной.

9. После добавления элюента его можно элюировать на водяной бане при 55 градусах в течение 5 минут или поместить в водяную баню при 50 градусах более чем на 10 минут, или запечатать парафильмом при 4 градусах на ночь, а затем центрифугировать для восстановления на следующий день, эффект хороший.

10. Добавьте отцентрифугированный элюат обратно в адсорбционную колонку и снова отцентрифугируйте.

Подробные методы и процедуры восстановления продукта ПЦР

1. Обычная переработка резины

Если вы хотите восстановить клей, лучше всего использовать набор, который удобен и имеет немного более высокую скорость восстановления.Если очень нужно восстановить вручную, то можно добавить 3-х кратный объем ТЭ после разрезания клея.После плавления на водяной бане фенол, фенол/хлороформ полностью экстрагируют, а этанол осаждают.Вот и все.

2. Восстановление ДНК из гелей с низкой температурой плавления

Очистка фрагментов ДНК. Добавьте TE (10 ммоль/л Трис-HCl pH 8,0, 0,1 ммоль/л ЭДТА) в количестве, равном объему геля, и поместите в водяную баню при 65°C на 5 минут для полного растворения геля.

После доведения до комнатной температуры добавляли равное количество фенола (насыщали ТЭ, ТЭ запечатывали в верхнем слое, а нижний слой фенола удаляли), смесь осторожно перемешивали (перемешивания не требовалось) и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 3 минут.Повторить 1-2 раза.

Возьмите супернатант, добавьте 0,1 объема 3 моль/л ацетата натрия (pH 5,2) и 2,5-кратного объема абсолютного этанола для проведения осаждения этанолом.Растворите очищенную ДНК с соответствующим количеством TE, измерьте содержание и подготовьте к использованию (его можно использовать для анализа структуры целевого гена, подготовки зонда и т. д.).

3. Восстановление ПЦР с хорошей специфичностью амплификации

Если специфичность амплификации ПЦР хорошая, это просто очистка и выделение продукта ПЦР.Вы можете добавить 50 мкг/мл протеиназы К к продукту ПЦР, 37 градусов в течение 1 часа, экстрагировать один раз фенолом/хлороформом, один раз экстрагировать хлороформом и добавить 0,1 объема супернатанта.Ацетат натрия выделяют осаждением 2,5 объемами абсолютного этанола.

Сопутствующие товары:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/