Недавно я обнаружил удивительную вещь!Многие продвинутые профессионалы-экспериментаторы вокруг него не знают даже некоторых элементарных экспериментальных знаний.

Например, можете ли вы ответить на следующие вопросы?

Есть ли разница между OD260 и A260?Что каждый означает?
OD — это аббревиатура оптической плотности (оптическая плотность), A — это аббревиатура абсорбции (абсорбции), эти два понятия на самом деле одинаковы, «оптическая плотность» — это «абсорбция», но «оптическая плотность» соответствует большинству национальных стандартов и более стандартизирована.

Обычно мы измеряем значение оптической плотности при 260 нм для расчета концентрации нуклеиновой кислоты, так что же представляет собой 1 оптическая плотность?
Нуклеиновая кислота имеет максимальный пик поглощения при длине волны 260 нм, в ней содержатся как ДНК, так и РНК, а также фрагментированные фрагменты нуклеиновых кислот (это ключевой момент).
Значение ОП, измеренное при длине волны 260 нм, регистрировали как ОП260.Если образец чистый, по значению OD260 можно рассчитать концентрацию образца нуклеиновой кислоты.
1 OD260=50 мкг/мл двухцепочечной ДНК (двухцепочечная ДНК)
=37 мкг/мл оцДНК (одноцепочечная ДНК)
=40 мкг/мл РНК
=30 мкг/мл dNTP (олигонуклеотиды)
Есть ли связь и разница между ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени и КПЦР?
ОТ-ПЦР — это сокращение от ПЦР с обратной транскрипцией.
ПЦР в реальном времени = qPCR, сокращение от Quantitative Real Time PCR
Хотя ПЦР в реальном времени (количественная флуоресцентная ПЦР в реальном времени) и ПЦР с обратной транскрипцией (ПЦР с обратной транскрипцией) кажутся сокращенными как ОТ-ПЦР.Но международная конвенция такова: ОТ-ПЦР конкретно относится к ПЦР с обратной транскрипцией.

Какие nt, bp и kb обычно используются для описания длины ДНК/РНК в биологии?
нт = нуклеотид
bp = пара оснований, пара оснований
kb = килобаза

Конечно, вы скажете, что многих людей не волнуют эти мелкие детали!Все так делают, и никто не спросит у вас, что это такое.Ты же знаешь, что это ненужно, да?

Нет, нет, нет, это очень нужно знать!из-за которой?
Потому что вы хотите опубликовать статью!Брат!Независимо от того, стремитесь ли вы к выпускному экзамену или стремитесь к научным исследованиям, вы должны полагаться на статьи, чтобы говорить!

Экстракция нуклеиновой кислоты должна быть самым простым и основным экспериментом.Качество выделения нуклеиновых кислот напрямую определяет результаты последующих экспериментов.

Хотя я говорил это много раз, все еще есть много друзей, которым все равно.В этот раз я решил уйти от статьи!

Минимальная информация для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени, именуемых MIQE, представляет собой набор руководств по проведению количественных экспериментов по флуоресценции, выпущенных на международном уровне, которые предлагают минимальные стандарты для экспериментальной информации, необходимой для оценки экспериментов по количественной ПЦР по флуоресценции и публикации статей.Благодаря экспериментальным условиям и методам анализа, предоставленным экспериментатором, рецензенты могут лучше оценить достоверность экспериментальной схемы исследователя.

Можно видеть, что в разделе выделения нуклеиновых кислот были предложены следующие элементы обнаружения:

«E» указывает на информацию, которая должна быть предоставлена, а «D» указывает на информацию, которая должна быть предоставлена ​​в случае необходимости.

Форма очень сложная, по сути, я хочу сказать, что всем нужно начинать с

чистота (D), выход (D), целостность (E) и консистенция (E) для оценки нуклеиновых кислот по этим четырем аспектам.

По экспериментальным привычкам сначала поговорим о методах оценки чистоты и концентрации.

Измерение ОП является любимым и самым простым методом обнаружения для экспериментаторов.Что касается принципа, то я не буду здесь вдаваться в подробности.Многие лаборатории в настоящее время используют ультрамикроспектрофотометры для непосредственного количественного анализа образцов нуклеиновых кислот.При отображении значения поглощения программа напрямую дает значение концентрации (нуклеиновой кислоты, белка и флуоресцентного красителя) и соответствующие соотношения.Что касается анализа значения OD, сохраните эту картинку и все будет хорошо.

Список решений для универсального значения OD

Тем не менее, есть несколько предостережений, которые необходимо сделать отдельно для вас.

(В конце концов, я знаю, что вы, должно быть, те, кто копит и ждет, пока они вам понадобятся!)

Примечание 1 Оборудование

На значение OD будет влиять различное оборудование.Пока OD260 находится в определенном диапазоне, значения OD230 и OD280 имеют смысл.Например, диапазон поглощения обычного Eppendorf D30 при 260 нм составляет 0–3 А, а NanoDrop One от Thermo — при 260 нм.Диапазон поглощения 0,5~62,5А.

Заметка 2Реагент для разбавления

На значение OD может влиять разбавление различных реагентов.Например, показания OD260/280 очищенной РНК при pH7,5 10 мМ Трисбуфер находится в пределах 1,9-2,1, а внейтральный водный растворсоотношение будет ниже, может всего 1,8-2,0, но это не значит, что качество РНК изменится.

Заметка 3Остаточные вещества

Наличие остаточных веществ будет влиять на точность измерения концентрации нуклеиновых кислот, поэтому необходимо максимально избегать остатков белков, фенолов, полисахаридов и полифенолов в образцах нуклеиновых кислот.

Однако на самом деле экстракция органическими реагентами — старый метод.В коммерческих наборах эффект экстракции может быть достигнут с помощью адсорбционной колонки на основе диоксида кремния в сочетании с центрифугированием, что позволяет избежать токсичных и вредных органических реагентов, которые трудно удалить, и т. д. Проблема, такая какНабор Foregene для выделения нуклеиновых кислот не использует ДНКазу/РНКазу и токсичные органические реагенты на протяжении всей операции, быстро и безопасно, иэффектхороший(случайно сказал, что был лысым, но я знаю, что вы хотите знать).

Пример 1: Выход и чистота экстракции геномной ДНК

Набор Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) предназначен для обработки образцов почвы из различных источников, а количество и чистота полученной геномной ДНК показаны в следующей таблице:
Пример 2: Выход и чистота экстракции тканевой РНК

Набор для выделения тотальной РНК животных (RE-03012) обрабатывал различные образцы тканей, и количество и чистота полученной РНК показаны в таблице ниже (для тканей мыши):
Однако не думайте, что вы закончили со значением OD.Есть ли у вас какие-либо заботы о ключевых моментах, которые я нарисовал для вас в начале?

Уведомление

Фрагментированные молекулы нуклеиновой кислоты также будут рассчитываться в абсорбции.Предполагая, что у вас есть остатки геномной ДНК в РНК, ваше значение ОП будет казаться очень высоким, но реальную концентрацию РНК определить невозможно.Является ли ваша РНК. Неясно, есть ли деградация, поэтому нам все еще нужен комплексный метод оценки, чтобы дать более точное суждение, то есть оценка целостности нуклеиновой кислоты, упомянутая в MIQE.