Ⅰ. Повысить чувствительность реакционной системы:
1. Отделить высококачественную РНК:
Успешный синтез кДНК происходит из высококачественной РНК.Качественная РНК должна обеспечивать по крайней мере общую длительность и не содержать ингибиторов, не содержащих регистрирующих ферментов, таких как ЭДТА или ДСН.Качество РНК определяет максимальное значение информации о последовательности, которую вы можете транскрибировать в кДНК.Общий метод очистки РНК представляет собой поэтапный метод с использованием изоцианата/ацидофенола.Чтобы предотвратить загрязнение РНКазой, РНК, выделенная из образца, богатого РНКазой (например, из поджелудочной железы), требует хранения формальдегида для сохранения высококачественной РНК, что особенно важно для длительного хранения.РНК, выделенная из печени крысы, в основном разлагалась после одной недели хранения в воде, в то время как РНК, выделенная из селезенки крысы, оставалась стабильной после трех лет хранения в воде.Кроме того, транскрипты размером более 4 т.п.н. более чувствительны к деградации следов РНКазы, чем небольшие транскрипты.Чтобы повысить стабильность образца РНК для хранения, РНК можно растворить в ионном металамине и хранить при температуре -70 ° C.Тилоид, используемый для сохранения РНК, не должен содержать посторонние объекты, разрушающие РНК.РНК, полученная из поджелудочной железы, может сохраняться в металамине не менее одного года.Когда вы будете готовы использовать РНК, вы можете использовать следующие методы для осаждения РНК: добавить NaCl к 0,2 М и 4-кратному объему этанола, поместить при комнатной температуре на 3–5 минут и центрифугировать при 10 000 × g в течение 5 минут.
2. Используйте обратную транскриптазу без активности РНКазы H (RNaseH-):
Ингибиторы РНКазы часто добавляют в реакции обратной транскрипции, чтобы увеличить длину и выход синтеза кДНК.Ингибитор РНКазы добавляется в реакцию синтеза первой цепи в присутствии буферов и восстанавливающих агентов, таких как DTT, потому что процесс синтеза пре-кДНК денатурирует ингибитор, тем самым высвобождая связанные РНКазы, которые расщепляют РНК.Ингибитор протеиновой РНКазы предотвращает только деградацию РНК РНКазами А, В, С и не предотвращает попадание РНКаз на кожу, поэтому следует соблюдать осторожность, чтобы не вводить РНКазы из пальцев, несмотря на использование этих ингибиторов.
Обратная транскриптаза катализирует превращение РНК в кДНК.Как M-MLV, так и AMV обладают эндогенной активностью РНКазы H в дополнение к собственной полимеразной активности.Активность РНКазы H конкурирует с активностью полимеразы в отношении гетерозиготных цепей, образованных между матрицами РНК и праймерами ДНК или удлиняющими цепями кДНК, и разрушает цепи РНК: РНК в комплексах ДНК.Матрицы РНК, расщепленные активностью РНКазы H, больше не могут использоваться в качестве эффективных субстратов для синтеза кДНК, что снижает выход и продолжительность синтеза кДНК.Таким образом, устранение или значительное снижение активности РНКазы Н обратной транскриптазы было бы очень полезным.
Обратная транскриптаза SuperScriptⅡ, обратная транскриптаза MMLV RNaseH- и обратная транскриптаза thermoScript, AMV RNaseH- дает больше полноразмерной кДНК, чем MMLV и AMV.На чувствительность ОТ-ПЦР влияет количество синтезированной кДНК.ThermoScript гораздо более чувствителен, чем AMV.Размер продуктов ОТ-ПЦР ограничен способностью обратной транскриптазы синтезировать кДНК, особенно при клонировании более крупных кДНК.По сравнению с MMLV, SuperScripⅡ значительно увеличивает выход продуктов длинной ОТ-ПЦР.Обратная транскриптаза RNaseH- также повышает термическую стабильность, поэтому реакцию можно проводить при температурах выше обычных 37-42℃.В предлагаемых условиях синтеза использовали олиго(dT) праймеры и 10 мкКи [альфа-p]dCTP.Общее производство первой цепи рассчитывали с использованием метода осаждения ТХУ.Полноразмерную кДНК анализировали с использованием полосок, отсортированных по размеру, и подсчета в щелочном агарозном геле.
3. Увеличьте температуру сохранения тепла обратной транскрипции:
Более высокая температура выдержки способствует раскрытию вторичной структуры РНК и увеличению выхода реакции.Для большинства матриц РНК выдерживание РНК и праймера при 65°C без буфера или соли, а затем их быстрое охлаждение на льду устраняет большинство вторичных структур и позволяет праймерам связываться.Однако некоторые шаблоны все еще имеют вторичную структуру даже после термической денатурации.Амплификацию этих сложных матриц можно проводить с помощью обратной транскриптазы ThermoScript и помещая реакцию обратной транскриптазы при более высоких температурах для улучшения амплификации.Более высокие температуры выдержки также могут повысить специфичность, особенно когда синтез кДНК осуществляется с использованием геноспецифических праймеров (GSPS) (см. главу 3).При использовании GSP убедитесь, что значение Tm грунтовки совпадает с ожидаемой температурой выдержки.Не используйте oligo(dT) и случайные праймеры при температуре выше 60℃.Рандомные праймеры необходимо выдержать при 25 ℃ в течение 10 минут, прежде чем повысить температуру до 60 ℃.Помимо использования более высоких температур обратной транскрипции, специфичность можно повысить путем прямого переноса смеси РНК/праймеров с температуры денатурации 65℃ на температуру выдержки обратной транскрипции и добавления предварительно нагретой двукратной реакционной смеси (термальный инициирующий синтез кДНК).Этот подход помогает предотвратить межмолекулярное спаривание оснований, которое происходит при более низких температурах.Использование прибора для ПЦР упрощает множество температурных переключений, необходимых для ОТ-ПЦР.
Термостабилизированная полимераза Tth действует как ДНК-полимераза в присутствии Mg2+ и РНК-полимераза в присутствии Mn2+.Он может удерживать тепло до 65 ℃.Однако присутствие Mn2+ во время ПЦР снижает точность, что делает полимеразу Tth менее пригодной для высокоточной амплификации, такой как клонирование кДНК.Кроме того, Tth менее эффективен при обратной транскрипции, что снижает чувствительность, а поскольку один фермент может выполнять обратную транскрипцию и ПЦР, контрольные реакции без обратной транскрипции нельзя использовать для отличия амплифицированных продуктов кДНК от продуктов загрязненной геномной ДНК.
4. Добавка, способствующая обратной транскрипции:
Добавление добавок, включая глицерин и ДМСО, в реакцию синтеза первой цепи может снизить стабильность двойной цепи нуклеиновой кислоты и раскрутить вторичную структуру РНК.Можно добавить до 20 % глицерина или 10 % ДМСО, не влияя на активность SuperScript II или MMLV.AMV также может переносить до 20% глицерина без снижения активности.Чтобы максимизировать чувствительность RT-PCR в реакции обратной транскрипции SuperScriptⅡ, можно добавить 10% глицерина и изолировать при 45 ℃.Если в ПЦР добавить 1/10 продукта реакции ретротранскрипции, то концентрация глицерина в реакции амплификации составит 0,4%, что недостаточно для ингибирования ПЦР.
5. Обработка РНКазы H:
Чувствительность можно улучшить, обработав реакции синтеза кДНК РНКазой Н перед ПЦР.Считается, что для некоторых матриц РНК в реакции синтеза кДНК предотвращает связывание амплифицированных продуктов, и в этом случае обработка РНКазой H может повысить чувствительность.Как правило, обработка РНКазой Н требуется для амплификации относительно длинной полноразмерной целевой матрицы кДНК, такой как клубневой схероз Ⅱ с низкой копией.Для этого сложного шаблона РНКаза H усилила сигнал, генерируемый кДНК, синтезированной с помощью SuperScript II или AMV.Для большинства реакций ОТ-ПЦР обработка РНКазой Н необязательна, поскольку стадия денатурации ПЦР в изолированной среде при 95℃ обычно гидролизует РНК из комплекса РНК: ДНК.
6. Усовершенствованные методы обнаружения небольших количеств РНК:
ОТ-ПЦР особенно сложна, когда доступны только небольшие количества РНК.Добавление гликогена в качестве носителя во время разделения РНК помогает увеличить выход небольших образцов.Гликоген, не содержащий РНКаз, можно добавлять одновременно с тризолом.Гликоген растворим в воде и может оставаться в водной фазе с РНК, что способствует последующему осаждению.Рекомендуемая концентрация гликогена без РНКазы составляет 250 мкг/мл для образцов менее 50 мг ткани или 106 культивируемых клеток.
Добавление ацетилированного БСА к реакциям обратной транскрипции с использованием SuperScript II может повысить чувствительность, а для небольших количеств РНК уменьшение количества SuperScript II и добавление 40 единиц ингибитора нуклеазы RnaseOut может повысить уровень обнаружения.Если для разделения РНК используется гликоген, по-прежнему рекомендуется добавление ингибиторов BSA или РНКазы в реакции обратной транскрипции с использованием SuperScript II.
Ⅱ. Повышение специфичности ОТ-ПЦР
1. Синтез cNDA:
Для инициации синтеза первой цепи кДНК можно использовать три разных метода, и относительная специфичность каждого метода влияет на количество и тип синтезируемой кДНК.
Метод случайных праймеров является наименее специфичным из трех методов.Праймеры отжигают в нескольких сайтах по всему транскрипту, чтобы получить короткую кДНК неполной длины.Этот метод часто используется для получения 5'-концевых последовательностей и кДНК из матриц РНК со вторичными структурными областями или с сайтами терминации, которые обратная транскриптаза не может реплицировать.Чтобы получить самую длинную кДНК, необходимо эмпирически определить соотношение праймеров и РНК в каждом образце РНК.Начальная концентрация случайных праймеров составляет от 50 до 250 нг на 20 мкл реакционной системы.Поскольку кДНК, синтезируемая из тотальной РНК с использованием случайных праймеров, в основном представляет собой рибосомную РНК, в качестве матрицы обычно выбирают поли(А)+РНК.
Инициация олиго(dT) более специфична, чем случайные праймеры.Он гибридизуется с поли(А)-хвостом, обнаруженным на 3'-конце мРНК в большинстве эукариотических клеток.Поскольку поли(А)+РНК составляет примерно от 1% до 2% всей РНК, количество и сложность кДНК намного меньше, чем если бы использовались случайные праймеры.Из-за своей высокой специфичности oligo(dT) обычно не требует оптимизации соотношения РНК и праймеров и отбора поли(А)+.Рекомендуется использовать 0,5 мкг олиго(дТ) на 20 мкл реакционной системы.oligo(dT)12-18 подходит для большинства ОТ-ПЦР.Система ThermoScript RT-PCR дает олиго(dT)20 из-за его хорошей термической стабильности и подходит для более высоких температур выдержки.
Ген-специфические праймеры (GSP) являются лучшими специфическими праймерами для стадии обратной транскрипции.GSP представляет собой антисмысловой олигонуклеозид, который может специфически гибридизоваться с последовательностями назначения РНК, а не отжигать все РНК, как случайные праймеры или олиго(dT).Правила, используемые для разработки праймеров для ПЦР, также применимы к разработке реакции обратной транскрипции GSP.GSP может иметь ту же последовательность, что и праймер для амплификации, гибридизованный на конце мРНК3', или GSP может быть разработан таким образом, чтобы его можно было гибридизовать ниже по течению с праймером для обратной амплификации.Для некоторых амплифицируемых объектов необходимо разработать более одного антисмыслового праймера для успешной ОТ-ПЦР, поскольку вторичная структура РНК-мишени может препятствовать связыванию праймера.Предлагается использовать 1 пмоль антисмыслового GSP в реакционной системе первого цепного синтеза объемом 20 мкл.
2. Увеличьте температуру сохранения тепла обратной транскрипции:
Чтобы в полной мере воспользоваться специфичностью GSP, следует использовать обратную транскриптазу с высокой термостабильностью.Термостабильную обратную транскриптазу можно изолировать при более высоких температурах, чтобы повысить строгость реакции.Например, если GSP отжигают при 55°C, то специфичность GSP не используется полностью, если обратную транскрипцию проводят при 37°C с низкой строгостью с использованием AMV или M-MLV.Однако SuperScripⅡ и ThermoScript могут реагировать при температуре 50 ℃ и выше, что устраняет неспецифические продукты, образующиеся при более низких температурах.Для максимальной специфичности смесь РНК/праймер может быть перенесена непосредственно из температуры денатурации 65℃ в температуру выдержки обратной транскрипции с добавлением предварительно нагретой двукратной реакционной смеси (тепловое инициирование синтеза кДНК).Это помогает предотвратить образование пар оснований между молекулами при низких температурах.Использование прибора для ПЦР упрощает множество температурных переходов, необходимых для ОТ-ПЦР.
3. Уменьшить загрязнение геномной ДНК:
Одна потенциальная трудность с ОТ-ПЦР заключается в том, что РНК загрязняет геномную ДНК.Использование более совершенных методов разделения РНК, таких как Trizol Reagent, снижает загрязнение геномной ДНК в препаратах РНК.Чтобы избежать продуктов, полученных из геномной ДНК, РНК можно обработать ДНК степени амплификации Ⅰ для удаления загрязненной ДНК перед обратной транскрипцией.Образцы хранили при 65 ℃ в 2,0 мМ ЭДТА в течение 10 минут, чтобы прекратить расщепление ДНКазой Ⅰ.ЭДТА хелатирует ионы магния, чтобы предотвратить зависимый от ионов магния гидролиз РНК, который происходит при высоких температурах.
Чтобы отделить амплифицированную кДНК от продукта амплификации геномной ДНК, можно сконструировать праймеры, которые отжигаются отдельно с отделенным экзоном.Продукты ПЦР, полученные из кДНК, будут короче, чем продукты, полученные из загрязненной геномной ДНК.Контролируемый эксперимент без обратной транскрипции также проводится на каждой матрице РНК, чтобы определить, происходит ли данный фрагмент из геномной ДНК или кДНК.Продукты ПЦР, полученные в отсутствие обратной транскрипции, происходят из генома.
Похожий продукт
- Одноэтапный набор позволяет проводить обратную транскрипцию и ПЦР в одной и той же пробирке.Нужно только добавить матричную РНК, специфические праймеры для ПЦР и ddH без РНКазы.2O.
-Количественный анализ РНК в реальном времени можно проводить быстро и точно.
- В наборе используется уникальный реагент обратной транскрипции Foregene и ДНК-полимераза Foregene HotStar Taq в сочетании с уникальной реакционной системой для эффективного повышения эффективности амплификации и специфичности реакции.
- Оптимизированная реакционная система обеспечивает более высокую чувствительность обнаружения, более сильную термическую стабильность и лучшую переносимость реакции.
-Эффективная возможность удаления гДНК, которая может удалить гДНК в шаблоне в течение 2 минут.
-Эффективная система обратной транскрипции, для завершения синтеза первой цепи кДНК требуется всего 15 минут.
- Сложные шаблоны: шаблоны с высоким содержанием GC и сложной вторичной структурой также можно реверсировать с высокой эффективностью.
-Высокочувствительная система обратной транскрипции, матрицы pg-уровня также могут получать высококачественную кДНК.
- Система обратной транскрипции обладает высокой термостабильностью, оптимальная температура реакции составляет 42 ℃, и она по-прежнему имеет хорошие характеристики обратной транскрипции при 50 ℃.
Время публикации: 07 марта 2023 г.
