Специфичность обнаружения

В большинстве случаев целью дизайна праймера является максимизация специфичности ПЦР.Это определяется более или менее предсказуемым влиянием многих переменных.Одной важной переменной является последовательность на 3'-конце праймера.

Важно отметить, что анализы ПЦР, предназначенные для специфичности, с большей вероятностью сохранят высокую эффективность в широком динамическом диапазоне, поскольку анализ не дает неспецифических продуктов амплификации, тем самым конкурируя с реагентами ПЦР или ингибируя основную реакцию амплификации.

Конечно, в некоторых случаях специфичность не является самым важным, например, когда целью является количественная оценка близкородственных, но разных патогенов, требуется специальный дизайн, стандарты оптимизации и проверки.

Кривая плавления является стандартным методом оценки специфичности ампликонов, по крайней мере, с точки зрения того, следует ли амплифицировать одну мишень.Однако следует подчеркнуть, что кривые плавления могут вводить в заблуждение, поскольку, например, на них может влиять комбинированное воздействие неоптимальных праймеров и низких концентраций матрицы.

P5 |Кривая плавления показывает сдвиги Tm, полученные при двух обнаружениях разных количеств двух ДНК-мишеней.

A. При более высоких концентрациях (ad)) очевидный димер праймера отсутствует после завершения измерения количественной ПЦР.При уменьшении концентрации матрицы до 50 копий (д) начинает появляться неспецифический продукт, который становится единственным продуктом при наименьшей концентрации (е).

B. Тест зафиксировал одинаковую Tms при всех целевых концентрациях, и не было явного димера праймера даже при самой низкой концентрации (5 копий).При использовании этих двух методов детекции продукты амплификации в НТК не обнаруживались.

На P5 показаны кривые растворения, полученные для образцов, в которых матрица присутствует в различных концентрациях.P 5a показывает, что при двух самых низких концентрациях Tms полученных продуктов неспецифической амплификации ниже, чем у специфических ампликонов.

Очевидно, что этот метод обнаружения нельзя надежно использовать для обнаружения целей, существующих в низких концентрациях.

Интересно, что NTC, т.е. образцы вообще без ДНК, не регистрировали (неспецифические) продукты амплификации, что указывает на то, что фоновая геномная ДНК может участвовать в неспецифической амплификации/полимеризации.

Иногда такие фоновые праймеры и неспецифическая амплификация не могут быть исправлены, но часто можно разработать метод детекции, не предусматривающий неспецифическую амплификацию при любой концентрации матрицы и NTC (P 5b).

Здесь даже запись увеличения целевой концентрации с Cq 35 будет давать специфическую кривую растворения.Точно так же NTC не проявляли признаков неспецифической амплификации.Иногда характер обнаружения может зависеть от маточного раствора, и в определенных композициях буфера обнаруживается только неспецифическая амплификация, что может быть связано с различными концентрациями Mg2+.

Стабильность обнаружения

Оптимизация Ta является полезным шагом в процессе эмпирической проверки и оптимизации обнаружения qPCR.Он обеспечивает прямое указание на надежность набора праймеров, показывая температуру (или диапазон температур), при которой достигается самый низкий уровень Cq без усиления NTC.

Разница в чувствительности в два-четыре раза может быть не важна для людей с высокой экспрессией мРНК, но для диагностических тестов она может означать разницу между положительными и ложноотрицательными результатами.

Свойства Ta праймеров для qPCR могут сильно различаться.Некоторые тесты не очень надежны, и если их не проводить при оптимальном значении Ta праймеров, они быстро разрушатся.

Это важно, потому что этот тип обнаружения часто проблематичен в реальном мире, а чистота образца, концентрация ДНК или присутствие другой ДНК могут быть не оптимальными.

Кроме того, целевое число копий может варьироваться в широких пределах, а реагенты, пластиковая посуда или инструменты могут отличаться от тех, которые использовались при настройке теста.

P6|Градиент температуры показывает различную надежность обнаружения ПЦР.

A. Используйте мастермикс Sensifast SYBR компании Bioline (каталожный номер BIO-98050) для проведения ПЦР на кДНК, полученной из РНК головного мозга человека.

B. Используйте прибор Bio-Rad CFX qPCR для записи карты амплификации и кривой растворения апалена (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. График амплификации и кривая плавления ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. График амплификации и кривая растворения GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cq, записанные при разных температурах отжига, демонстрирующие разницу в Cq, записанных при градиенте температуры 7°C.

P 6 показывает типичный результат нежелательного теста, в котором кПЦР проводили с использованием градиента Tas между 59°C и 67°C (P 6a) с использованием праймеров для трех генов, специфичных для головного мозга человека.

Из графика амплификации видно, что праймеры Opalin далеки от идеальных, потому что их оптимальный диапазон Ta очень узок (рис. 6b), то есть Cqs широко рассредоточены, в результате чего Cqs значительно сравниваются с их оптимальными Cqs Low.

Этот метод обнаружения нестабилен и может привести к субоптимальному усилению.Следовательно, эта пара праймеров должна быть переработана.Кроме того, анализ кривой плавления (вставка) показывает, что специфичность этого метода обнаружения также может быть проблематичной, поскольку кривая плавления каждого Та различна.

Метод обнаружения ACSBG1, показанный на P 6c, является более надежным, чем описанный выше метод обнаружения Opalin, но он все еще далек от идеала, и вполне вероятно, что его можно улучшить.

Однако мы подчеркиваем, что нет необходимой связи между надежностью и специфичностью, потому что кривая растворения, полученная с помощью этого метода обнаружения, показывает одинаковое пиковое значение для всех Tas (вставка).

С другой стороны, тест на устойчивость гораздо более толерантный, давая аналогичные Cq в широком диапазоне Tas, как в тесте GFAP, показанном на P 6d.

Разница в Cqs, полученных в том же диапазоне 8 градусов Цельсия, составляет менее 1, а кривая растворения (вставка) подтверждает характеристики обнаружения в этом диапазоне температур.Стоит отметить, что расчетный диапазон Tas и фактический диапазон Ta могут сильно отличаться.

Существует множество руководств, призванных помочь исследователям в разработке эффективных праймеров, большинство из которых основано на давно установленных правилах, и большое внимание уделяется 3'-концу праймеров.Часто рекомендуется включать G или C на 3'-конце и два основания G или C (зажим GC), но не более двух из последних 5 оснований.

На практике эти правила могут служить ориентиром для исследователей, но они не обязательно верны при любых обстоятельствах.

P7 |3'-конец праймера мало влияет на специфичность или эффективность.

А. Положение праймеров для гена HIF-1α человека (NM_181054.2).

B. Используйте маточный раствор Agilent Brilliant III SYBR Green (кат. № 600882) для амплификации шести испытуемых образцов.

C. График амплификации и кривая плавления, записанные с помощью прибора Bio-Rad CFX qPCR и 3'-концевых праймеров.NTC показаны красным цветом.

D. Запись Cqs для каждого элемента теста

Например, результат в P 7 противоречит правилу 3'-конца.Все конструкции дают в основном одинаковые результаты, только две комбинации праймеров приводят к неспецифической амплификации NTC.

Однако мы не можем поддержать эффект клипа GC, потому что в этом случае использование A или T как максимум 30 оснований не снижает специфичность.

Тест C, где праймер F заканчивается на GGCC, действительно записал Cq в NTC, указывая на то, что можно было бы избежать этих последовательностей на 30-конце.Мы подчеркиваем, что единственный способ определить наилучшую 3'-концевую последовательность пары праймеров — это экспериментально оценить некоторые праймеры-кандидаты.

Эффективность усиления

Важно отметить, что хотя неспецифическая ПЦР-детекция никогда не может стать специфичной, эффективность амплификации можно регулировать и максимизировать различными способами, изменяя фермент, маточный раствор, добавки и условия циклирования.

Для оценки эффективности ПЦР-детекции лучше всего использовать серийное разведение нуклеиновой кислоты-мишени в 10 или 5 раз, то есть «метод стандартной кривой».

Если для построения стандартной кривой используются ПЦР-ампликоны или синтетические ДНК-мишени, серийные разведения этих мишеней следует смешивать с постоянным количеством фоновой ДНК (например, геномной ДНК).

P8 |Кривая разбавления для оценки эффективности ПЦР.

A. Используйте праймеры для HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA и R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC и мастер-микс Agilent Brilliant III SYBR Green (каталожный номер 600882) для ПЦР и условий кривой плавления.

B. 100 нг РНК подвергали обратной транскрипции, разбавляли в 2 раза, а серийно разведенные образцы кДНК разводили в 5 раз до 1 нг геномной ДНК человека.Кривая плавления показана на вставке.

C. Реакцию RT, разведение и серийное разведение повторяли для второго образца кДНК, и результаты были сходными.

На Р 8 показаны две стандартные кривые с использованием одного и того же метода детекции на двух разных образцах кДНК, результатом является одинаковая эффективность, около 100%, и значение R2 также аналогично, то есть степень соответствия между экспериментальными данными и линией регрессии или Степень линейности данных.

Две стандартные кривые сравнимы, но не совсем одинаковы.Если целью является точное количественное определение мишени, необходимо отметить, что недопустимо предоставлять расчет количества копий без объяснения неопределенности.

P9 |Неопределенность измерения, связанная с количественным определением с использованием стандартной кривой.

A. Используйте праймеры для GAPDH (NM_002046) для выполнения ПЦР и условий кривой плавления.F: ACAGTTGCCATGTAGACC и R: TAACTGGTTGAGCACAGG и мастермикс Bioline Sensifast SYBR (каталожный номер BIO-98050).

B. Диаграмма амплификации, кривая плавления и стандартная кривая, записанные с помощью прибора Bio-Rad CFX qPCR.

C. График стандартной кривой и 95% доверительный интервал (ДИ).

D. Количество копий и 95% доверительный интервал трех значений Cq, полученных из кривой разбавления.

P 9 показывает, что для оптимизированного теста собственная изменчивость одной стандартной кривой составляет приблизительно 2 раза (95% доверительный интервал, минимум до максимума), что может быть наименьшей ожидаемой изменчивостью.

Похожий продукт:

Набор Cell Direct RT для количественной ПЦР

Набор для прямой ПЦР с хвостом мыши

Набор для прямой ПЦР на ткани животных