COVID-19 — это инфекционное заболевание, вызываемое коронавирусом типа 2 тяжелого острого респираторного синдрома. Наиболее распространенными симптомами инфицирования человека являются лихорадка, кашель и одышка.

Образцы, используемые для тестирования, могут быть собраны с помощью мазков из носоглотки или ротоглотки.

Что такое ПЦР?

Стандартным методом выявления коронавируса является полимеразная цепная реакция, ПЦР.Этот метод широко используется в молекулярной биологии.Он может быстро копировать от миллионов до миллиардов специфических фрагментов ДНК.

Новый коронавирус содержит очень длинный одноцепочечный РНК-геном.Чтобы обнаружить эти вирусы с помощью ПЦР, молекулы РНК должны быть преобразованы в комплементарные последовательности ДНК с помощью обратной транскриптазы, а затем вновь синтезированная ДНК может быть амплифицирована с помощью стандартных процедур ПЦР, широко известных как ОТ-ПЦР.

Процесс ОТ-ПЦР

экстракция РНК

Для выполнения этого метода необходимо выделить вирусную РНК.Для удобного, быстрого и эффективного разделения можно использовать различные наборы для очистки РНК.

Чтобы извлечь вирусную РНК с помощью коммерческого набора, сначала добавьте образец в микроцентрифужную пробирку, а затем смешайте его с лизисным буфером.Этот буфер сильно денатурирован и обычно состоит из фенола и изотиоцианата гуанидина.Кроме того, в буфере для лизиса обычно присутствуют ингибиторы РНКазы, чтобы гарантировать выделение интактной вирусной РНК.

После добавления буфера для лизиса встряхните пробирку для смешивания импульсным способом и инкубируйте при комнатной температуре.Затем вирус лизируют в сильно денатурирующих условиях, обеспечиваемых лизирующим буфером.

После лизиса образца центрифужная пробирка используется для процедуры очистки.Образец загружается в центрифужную пробирку, а затем центрифугируется.

Эта процедура представляет собой метод твердофазной экстракции, в котором неподвижная фаза состоит из матрицы силикагеля.

При оптимальных солевых и рН-условиях молекулы РНК связываются с кварцевой мембраной.

При этом белок и другие загрязнения удаляются.

После центрифугирования поместите центрифужную пробирку в чистую пробирку для сбора, удалите фильтрат и добавьте промывочный буфер.

Поместите пробирку в центрифугу снова, чтобы заставить промывочный буфер пройти через мембрану.Это удалит все оставшиеся примеси с мембраны, оставив только РНК, связанную с силикагелем.

После того, как образец промыт, поместите пробирку в чистую микроцентрифужную пробирку и добавьте элюирующий буфер.

Затем его центрифугируют, чтобы протолкнуть элюирующий буфер через мембрану.Буфер для элюции удаляет вирусную РНК из спин-колонки и получает очищенную РНК, свободную от белков, ингибиторов и других загрязнителей.

ШАГ 2

Смешанный концентрат

После выделения вирусной РНК следующим шагом является подготовка реакционной смеси для ПЦР-амплификации.На этом этапе используется концентрат.Этот концентрированный раствор представляет собой предварительно смешанный концентрированный раствор, состоящий из премикса, обратной транскриптазы, нуклеотидов, прямого праймера, обратного праймера, зонда TaqMan и ДНК-полимеразы.

Наконец, чтобы завершить эту реакционную смесь, добавляется матрица РНК.Пробирки перемешивают импульсным встряхиванием, а затем реакционную смесь загружают в планшет для ПЦР.Планшет для ПЦР обычно содержит 96 лунок и может одновременно анализировать несколько образцов.

ШАГ 3

ПЦР-амплификация

Затем поместите пластину в машину ПЦР, которая по сути является термоциклером.

ОТ-ПЦР в реальном времени используется для обнаружения нового коронавируса 2019 года путем амплификации целевой последовательности в гене RdrRP, гене E и гене N.Выбор гена-мишени зависит от последовательности праймера и зонда.

Первым этапом ОТ-ПЦР является обратная транскрипция.Синтезируется первая цепь комплементарной ДНК, которая инициируется обратным праймером ПЦР, который связывается с комплементарной частью генома вирусной РНК.Затем обратная транскриптаза добавляет нуклеотиды ДНК к 3'-концу праймера для синтеза ДНК, комплементарной вирусной РНК.Температура и продолжительность этого этапа зависят от используемых праймеров, целевой РНК и обратной транскриптазы.

Затем применяется начальная стадия денатурации, в результате которой происходит денатурация гибрида РНК-ДНК.Этот шаг необходим для активации ДНК-полимеразы.При этом обратная транскриптаза инактивируется.

ПЦР состоит из серии термических циклов.Каждый цикл состоит из этапов денатурации, отжига и удлинения.

Стадия денатурации включает нагрев реакционной камеры до 95 градусов Цельсия и использование ее для денатурации матрицы двухцепочечной ДНК.

На следующем этапе температуру реакции снижают до 58 градусов по Цельсию, позволяя прямому праймеру отжигаться с комплементарной частью его матрицы одноцепочечной ДНК.Температура отжига напрямую зависит от длины и состава грунтовки.

На этапе удлинения ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК, комплементарную цепи ДНК-матрицы.Путем добавления свободных ядер, комплементарных матрице, в направлении от 5' к 3' из реакционной смеси.Температура этого этапа зависит от используемой ДНК-полимеразы.

После первого цикла получается двухцепочечная ДНК-мишень.

Затем введите второй цикл.Двухцепочечная ДНК денатурируется с образованием двух одноцепочечных молекул ДНК.

На следующем этапе температуру реакции снижают, праймеры отжигают с каждой одноцепочечной ДНК-матрицей, а зонд Taq-man отжигают с комплементарной частью ДНК-мишени.

Зонд TaqMan состоит из флуорофора, ковалентно связанного с 5'-концом олигонуклеотидного зонда.При возбуждении источником света циклера флуорофор излучает флуоресценцию.Кроме того, зонд состоит из гасителя на 3'-конце.Близость репортерного гена к гасителю препятствует обнаружению флуоресценции.

На этапе удлинения ДНК-полимераза синтезирует новую цепь.Когда полимераза достигает зонда TaqMan, ее эндогенная 5'-нуклеазная активность расщепляет зонд, отделяя краситель от гасителя.

С каждым циклом ПЦР высвобождается больше молекул красителя, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции пропорционально количеству синтезированных ампликонов.

Этот метод позволяет оценить количество данной последовательности, присутствующей в выборке.Количество двухцепочечных фрагментов ДНК удваивается в каждом цикле.Поэтому ПЦР можно использовать для анализа очень маленьких образцов.

Для измерения флуоресцентного сигнала, вольфрамовой галогенной лампы, фильтра возбуждения, рефлектора, линзы, фильтра излучения и устройства с зарядовой связью используйте ПЗС-камеру.

ШАГ 4. Обнаружение

Для измерения флуоресцентного сигнала, вольфрамовой галогенной лампы, фильтра возбуждения, рефлектора, линзы, фильтра излучения и устройства с зарядовой связью используйте ПЗС-камеру.

Отфильтрованный свет от лампы отражается отражателем, проходит через конденсорную линзу и фокусируется в центре каждого отверстия.Затем испускаемая отверстием флуоресценция отражается от зеркала, проходит через эмиссионный фильтр и регистрируется ПЗС-камерой.В каждом цикле ПЦР самовозбуждающийся свет флуорофора может быть обнаружен с помощью ПЗС.

Он преобразует захваченный свет в цифровые данные.Этот метод называется ПЦР в реальном времени, и он позволяет отслеживать в реальном времени ход реакции ПЦР.