ПЦР, несколько ПЦР, ПЦР in situ, Обратный ПЦР, ОТ-ПЦР, КПЦР (1)–ПЦР

Разберем концепции, этапы и детали различных ПЦР

Ⅰ. ПЦР

Полимеразная цепная реакция, известная как ПЦР, представляет собой молекулярно-биологическую технологию, которая используется для увеличения определенных фрагментов ДНК.Это можно рассматривать как особую репликацию ДНК in vitro.ДНК-полимераза (ДНК-полимераза I) была открыта еще в 1955 году, а фрагмент Кленова E. Coli, который имеет экспериментальную ценность и практичность, был открыт доктором Х. Кленоу в начале 1970-х годов, но поскольку этот фермент не переносит температуру, высокая температура может привести к его дегенерации, поэтому он не отвечает полимеразной цепной реакции с высокотемпературной дегенерацией.Используемые сегодня ферменты (называемые Taq-полимеразой) были выделены из Thermus aquaticus, бактерии горячих источников, в 1976 году. Его характеристика заключается в том, что он может противостоять высоким температурам и является идеальным ферментом, но он широко используется после 1980-х годов.Первоначальная концепция исходного примитивного прототипа ПЦР аналогична репарации и копированию генов, которая была предложена доктором К.Джеллом Клеппе в 1971 году. Он опубликовал первую простую и краткосрочную копию гена (аналогичную первым двум циклическим реакциям ПЦР).Разработанная сегодня ПЦР была разработана доктором Кэри Б. Маллис в 1983 году. В том году д-р Маллис обслуживал компании, занимающиеся производством ПЭ, поэтому ПЭ имеет особый статус в индустрии ПЦР.Д-р Маллис официально опубликовал первую связанную статью с Сайки и другими в 1985 году. С тех пор использование ПЦР составляет тысячи миль в день, и можно сказать, что качество связанных статей делает многие другие методы исследования неприятными.Впоследствии технология ПЦР широко используется в биологических научных исследованиях и клинических применениях, став наиболее важной технологией молекулярно-биологических исследований.Маллис также получил Нобелевскую премию по химии 1993 года.

ПЦРПринцип

Основной принцип технологии ПЦР аналогичен естественному процессу репликации ДНК, а его специфичность зависит от олигонуклеотидного праймера, комплементарного обоим концам целевой последовательности.ПЦР состоит из трех основных стадий дегенерации-отжига-удлинения ДНК: ① Дегенерация матричной ДНК: после того, как матричная ДНК нагревается примерно до 93 °C в течение определенного периода времени, раствор двойной ДНК для двухцепочечной ДНК, образованный путем ПЦР-амплификации матричной ДНК, уходит, превращает ее в единую цепь, чтобы ее можно было объединить с праймером для подготовки к следующему раунду реакции.② Отжиг (соединение) ДНК-матрицы и праймера: после того, как ДНК-матрица нагревается и вырождается в единую цепь, температура падает примерно до 55°C.Комплементарные последовательности праймера и матричной ДНК одноцепочечные.③Удлинение праймера: ДНК-шаблон - связывание праймера основано на действии полимеразы TaqDNA с dNTP в качестве сырья для реакции.Сохраняя принцип репликации, синтезируйте новую полузарезервированную цепочку копий, которые дополняют цепочку матричной ДНК, и повторите цикл дегенерация-отжиг-расширение трех процессов, чтобы получить больше «полузарезервированных цепочек копий», и эта новая цепочка снова доступна, чтобы стать шаблоном для следующего цикла.Для завершения петли требуется 2-4 минуты, целевой ген может быть амплифицирован несколько миллионов раз за 2-3 часа.

СтандартПЦРСистема реакции

Пять элементов реакции ПЦР

В ПЦР участвуют в основном пять видов веществ, а именно праймер, фермент, dNTP, матрица и буфер (требуется Mg2+).[Процедура ПЦР]

Стандартный процесс ПЦР разделен на три этапа.

1. Дегенерация ДНК (90°C-96°C): матрицы двухцепочечной ДНК при термическом воздействии разрывают водородные связи, образуя одноцепочечную ДНК.

2. Отжиг (25 ℃ -65 ℃): температура системы снижается, праймер объединяется с матрицей ДНК, образуя локальную двойную цепь.

3. Удлинение (70 ℃ -75 ℃): под действием фермента Taq (около 72 ° C, наилучшая активность) dNTP используется в качестве сырья, простирается от 5'-конца праймера → 3'-конец, синтез и матрица дополняют друг друга цепи ДНК.

Каждый цикл денатурируется, отжигается и расширяется, удваивая содержание ДНК.В настоящее время из-за короткой области амплификации некоторые ПЦР могут быть воспроизведены за очень короткое время, даже если активность фермента Taq не является оптимальной, поэтому ее можно изменить на две стадии, то есть отжиг и удлинение могут выполняться при 60°C-65°C одновременно.Для того, чтобы уменьшить процесс подъема и охлаждения и улучшить скорость отклика.

Особенности реакции ПЦР

● Высокая специфичность

Конкретными решающими факторами ответа ПЦР являются: ① Специфическая комбинация праймера и матричной ДНК.② Принцип спаривания оснований.③Лояльность реакции синтеза полимеразы TaqDNA.④Специфичность и консервативность целевого гена.

Правильная комбинация праймеров и шаблонов является ключом.Связывание праймера и матрицы и удлинение цепи праймера основано на принципе соответствия щелочного основания.Лояльность реакций синтеза полимеразы и устойчивость ДНК-полимеразы Taq к высокой температуре, чтобы связывание (соединение) матрицы и праймера в реакции можно было проводить при более высокой температуре.Специфичность комбинации значительно повышается.Клип может поддерживать высокую степень правильности.Выбирая целевую генетическую область с высокой консервативностью и высокой консервативностью, ее специфичность выше.

● Высокая чувствительность

Объем производства продуктов ПЦР увеличен на индекс, что позволяет расширить стартовый шаблон Пикера (PG=10-12) для повышения уровня микроконтроллера до уровня микрограммов (мкг=-6).Клетки-мишени могут быть обнаружены из 1 миллиона клеток;при обнаружении вирусов чувствительность ПЦР может достигать 3 RFU (пустые пятна образовались единицы);минимальная скорость обнаружения в бактериологии составляет 3 бактерии.

● Просто и быстро

В отражении ПЦР используется высокотемпературная ДНК-полимераза Taq, которая добавляет реакционный раствор за один раз, то есть реакция вырождения-отжига-удлинения в растворе для амплификации ДНК и емкости с водяной баней.Обычно реакция амплификации завершается через 2-4 часа.Дополненные продукты обычно анализируются с помощью электрического меча, и в них не нужно использовать изотопы, нет радиоактивного загрязнения и легко продвигать.

● Низкая чистота образца

Нет необходимости разделять вирусы или бактерии и культуральные клетки.Неочищенные продукты ДНК и РНК можно использовать в качестве усилителей.Обнаружение амплификации ДНК можно использовать непосредственно с использованием клинических образцов, таких как кровь, биологические жидкости, жидкости для промывания от кашля, волосы, клетки и живые ткани.

ПЦРобщие проблемы

● Ложноотрицательный результат, полосы без усиления

Ключевые этапы реакции ПЦР включают: ① приготовление матричных нуклеиновых кислот, ② качество и специфичность праймеров, ③ качество ферментов, ④ условия цикла ПЦР.Поиск причины также должен быть проанализирован и изучен по вышеуказанным ссылкам.

Матрицы: ① Матрица содержит различный белок, ② Матрица содержит ингибитор фермента Taq, ③ Белок в матрице не удаляется, особенно групповой белок в хромосоме.⑤ Дегенерация нуклеиновых кислот Deminer не является полной.При хорошем качестве ферментов и праймеров полоса амплификации отсутствует, что, скорее всего, связано с перевариванием образцов.Что-то не так с процессом извлечения матричных нуклеиновых кислот, поэтому для приготовления эффективного и стабильного раствора для расщепления его процедура должна быть фиксированной, а не произвольно измененной.

Инактивация фермента: новый фермент или как старый, так и новый ферменты следует использовать вместе, чтобы проанализировать, потеряна или недостаточна активность фермента, что приводит к ложноотрицательным результатам.Следует отметить, что фермент Taq или бромид этидия иногда забывают.

Праймер: качество праймера, концентрация праймера и симметричность концентрации двух праймеров.Это частая причина неудачи ПЦР, или увеличивающаяся полоса не идеальна и склонна к диффузии.Есть проблемы с качеством капсюлей некоторых серийных номеров.Два праймера имеют высокую концентрацию и низкую концентрацию, вызывая низкоэффективную асимметричную амплификацию.Контрмеры: ① Выберите хороший праймер для синтеза единиц.② Концентрация праймера зависит не только от значения OD, но также обращает внимание на исходную жидкость праймера для проведения электрофореза в агар-сахарном геле.Должна быть полоска грунтовки, а яркость двух грунтовок должна быть в целом одинаковой.Пояс, в это время ПЦР может дать сбой, и это должно быть решено с помощью блока синтеза праймеров.Если праймер высокий, яркость низкая, и его концентрацию необходимо сбалансировать при разбавлении.③ Грунтовка должна быть оплачена и храниться в высокой концентрации, чтобы предотвратить многократное замораживание или длительное охлаждение частей холодильника, что приведет к порче и деградации грунтовки.④ Конструкция праймера нецелесообразна, например, длина праймера недостаточна, и между праймерами формируется дикластер.

Концентрация Mg2+: концентрация ионов Mg2+ оказывает большое влияние на эффективность ПЦР-амплификации.Чрезмерная концентрация может уменьшить амплификацию ПЦР противоположного пола.Если концентрация слишком низкая, выход ПЦР-амплификации даже приведет к сбою ПЦР-амплификации без полосы расширения.

Изменение объема реакции: объем, используемый для амплификации ПЦР, составляет 20 мкл, 30 мкл и 50 мкл или 100 мкл, большой объем заявки на амплификацию ПЦР устанавливается в соответствии с различными целями научных исследований и клинических испытаний.После изготовления небольших объемов, таких как 20 мкл, необходимо сделать условие шнура при изготовлении размера, иначе он выйдет из строя.

Физические причины: трансформация очень важна для ПЦР-амплификации.Если температура дегенерации низкая, время дегенерации короткое, это может привести к ложноотрицательным результатам;слишком низкая температура отжига может вызвать неспецифическое усиление и снизить удельную эффективность усиления.Сильно влияет на комбинацию праймеров и матриц для снижения эффективности амплификации ПЦР.Иногда необходимо использовать стандартные термометры для обнаружения изменчивости, отжига и расширенной температуры в надстройке или водорастворимом варочном аппарате, что является одной из причин неудачи ПЦР.

Варианты целевой последовательности: при возникновении целевой последовательности, мутации или делеции, комбинации прототипа и матрицы, или из-за отсутствия целевой последовательности праймер и матрица потеряют комплементарную последовательность, и ее ПЦР-амплификация не будет успешной.

● Ложноположительный результат

Полоса ПЦР-амплификации соответствует полосе целевой последовательности, а иногда ее полоса более четкая и выше.

Дизайн праймера не подходит: выбранная последовательность амплификации и последовательность нецелевой амплификации гомологичны, поэтому при амплификации ПЦР амплифицированные продукты ПЦР представляют собой нецелевые последовательности.Последовательность-мишень слишком короткая или праймер слишком короткий, и она склонна к ложноположительному результату.Необходимо переоформить.

Перекрестное загрязнение целевой последовательности или продуктов амплификации: существует две причины такого загрязнения: во-первых, перекрестное загрязнение всего генома или его больших сегментов, приводящее к ложноположительным результатам.Этот тип ложноположительного результата можно решить следующими методами: Будьте осторожны и осторожны во время работы, чтобы не допустить попадания целевой последовательности в пистолет для проб или разбрызгивания из центрифужной пробирки.За исключением ферментов и веществ, не выдерживающих высоких температур, все реагенты или оборудование следует дезинфицировать под высоким давлением.Центробежные трубы и образцы следует использовать одновременно.При необходимости перед добавлением образцов реакционную пробирку и реагент подвергают воздействию ультрафиолетовых лучей для разрушения имеющейся нуклеиновой кислоты.Во-вторых, мелкие фрагменты в загрязнении воздуха.Эти небольшие фрагменты короче последовательности-мишени, но имеют определенную гомологию.Его можно сращивать друг с другом.После дополнения праймеров продукт ПЦР может быть расширен, что приведет к ложноположительному результату.Его можно использовать для сокращения или исключения метода гнездовой ПЦР.

● Появляются полосы неспецифической амплификации

Полосы, появившиеся после ПЦР-амплификации, не соответствуют ожидаемому размеру, либо большие, либо маленькие, либо в одно и то же время, либо в одно и то же время, полосы специфической амплификации и полосы неспецифической амплификации.Появление неспецифических полос происходит: во-первых, праймеры не полностью комплементарны целевой последовательности, или полимеризация праймера с образованием дикластера.Во-вторых, концентрация ионов MG2+ слишком высока, температура отжига слишком низка, и количество циклов ПЦР связано.Во-вторых, качество и количество ферментов.Часто ферменты одних источников склонны к неспецифическим полосам, а ферменты другого источника не встречаются.Иногда также происходит неспецифическая амплификация ферментов.Контрмеры: при необходимости перепроектировать привлекательные элементы.Уменьшите количество фермента или замените фермент из другого источника.Уменьшите количество первичных, соответствующим образом увеличьте количество шаблонов и уменьшите количество циклов.Надлежащим образом увеличьте температуру отжига или используйте метод двух температурных точек (дегенерация 93°C, отжиг и удлинение примерно при 65°C).

● Появление хлопьевидной пакли или липкой ленты

ПЦР-амплификация иногда оказывается наложенной либо на шелушащуюся, либо на коврообразную ленту.По этой причине из-за избыточного количества ферментов или низкого качества фермента концентрация dNTP слишком высока, концентрация Mg2+ слишком высока, температура отжига слишком низкая, а количество циклов слишком велико.Контрмеры: ①Уменьшите количество ферментов или замените фермент из другого источника.②Уменьшить концентрацию dNTP. ③Правильно уменьшить концентрацию Mg2+.④Увеличьте количество шаблонов и уменьшите количество циклов.

сопутствующие товары

PCR Heroᵀᴹ (с красителем)

◮ Более высокая точность: в 6 раз выше, чем у обычного фермента Taq;

◮ Более высокая скорость усиления

◮ Больше адаптивности шаблона

◮ Более высокая эффективность усиления

◮ Устойчивость к окружающей среде сильнее: при температуре 37°C в течение недели сохраняется активность более 90%;

◮ Обладает 5'→3' ДНК-полимеразной активностью и 5'→3'-экзонуклеазной активностью без 3'→5'-экзонуклеазной активности.

PCR Easyᵀᴹ (с красителем)

Уникальная реакционная система и высокоэффективная ДНК-полимераза Taq обеспечивают более высокую эффективность амплификации, специфичность и чувствительность реакции ПЦР.

РТ-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ Одноэтапный набор позволяет выполнять две реакции обратной транскрипции и количественной ПЦР в одной и той же пробирке, нужно только добавить матричную РНК, специфические праймеры для ПЦР и ddH без РНКазы₂O.

◮ Набор позволяет быстро и эффективно проводить количественный анализ вирусной РНК или следов РНК.

◮ В наборе используется уникальный реагент обратной транскрипции Foregene и ДНК-полимераза Foregene HotStar Taq в сочетании с уникальной реакционной системой для эффективного повышения эффективности амплификации и специфичности реакции.

◮ Оптимизированная реакционная система обеспечивает более высокую чувствительность обнаружения реакции, более высокую термическую стабильность и лучшую переносимость.

◮ RT-qPCR Easy^TMНабор (One Step)-SYBR Green I поставляется с внутренним эталонным красителем ROX, который можно использовать для устранения фонового сигнала и ошибок сигнала между лунками, что удобно клиентам для использования в различных моделях инструментов для количественной ПЦР.

РТ Легко^TMII (Мастер-премикс для синтез первой цепи кДНК дляПЦР в реальном времени)

-Эффективная возможность удаления гДНК, которая может удалить гДНК в шаблоне в течение 2 минут.

-Эффективная система обратной транскрипции, для завершения синтеза первой цепи кДНК требуется всего 15 минут.

- Сложные шаблоны: шаблоны с высоким содержанием GC и сложной вторичной структурой также можно реверсировать с высокой эффективностью.

-Высокочувствительная система обратной транскрипции, матрицы pg-уровня также могут получать высококачественную кДНК.

- Система обратной транскрипции обладает высокой термостабильностью, оптимальная температура реакции составляет 42 ℃, и она по-прежнему имеет хорошие характеристики обратной транскрипции при 50 ℃.