Значение Ct является наиболее важной формой представления результатов количественной флуоресцентной ПЦР.Он используется для расчета различий в экспрессии генов или количества копий генов.Итак, какое значение Ct для количественного определения флуоресценции считается разумным?Как обеспечить эффективный диапазон значения Ct?
Что такое значение Ct?
В процессе амплификации кПЦР соответствующее количество циклов амплификации (порог цикла), когда сигнал флуоресценции амплифицированного продукта достигает установленного порога флуоресценции.C означает цикл, а T означает порог.Проще говоря, значение Ct — это количество циклов, соответствующее моменту, когда начальная амплификация матрицы достигает определенного количества продукта в количественной ПЦР.О так называемом «определенном количестве продукта» будет сказано ниже.
Что делает значение Ct?
1. Взаимосвязь между экспоненциальным усилением, количеством шаблона и значением Ct
В идеале гены в qPCR накапливаются путем экспоненциальной амплификации после определенного количества циклов.Соотношение между количеством циклов амплификации и количеством продуктов таково: Количество амплифицированного продукта = исходное количество шаблона × (1+En) количество циклов.Однако реакция qPCR не всегда находится в идеальной ситуации.Когда количество амплифицированного продукта достигает «определенного количества продукта», число циклов в это время равно значению Ct, и оно находится в периоде экспоненциальной амплификации.Зависимость между значением Ct и количеством начального шаблона: существует линейная зависимость между значением Ct шаблона и логарифмом начального числа копий шаблона.Чем выше исходная концентрация темплата, тем меньше значение Ct;чем ниже начальная концентрация темплата, тем больше значение Ct.
2. Кривая амплификации, порог флуоресценции и определенное количество продукта ПЦР
Количество продукта амплификации КПЦР непосредственно представлено в виде флуоресцентного сигнала, то есть кривой амплификации.На ранней стадии ПЦР амплификация проходит в идеальных условиях, количество циклов невелико, накопление продукта невелико, уровень флуоресценции нельзя четко отличить от фона флуоресценции.После этого флуоресценция увеличивается и переходит в экспоненциальную фазу.Количество продукта ПЦР можно определить в определенный момент, когда реакция ПЦР находится как раз в экспоненциальной фазе, которую можно использовать как «определенное количество продукта», и из этого можно вывести начальное содержание матрицы.Следовательно, интенсивность сигнала флуоресценции, соответствующая определенному количеству продукта, является порогом флуоресценции.
На поздней стадии ПЦР кривая амплификации больше не показывает экспоненциальную амплификацию и переходит в линейную фазу и фазу плато.
3. Воспроизводимость значений Ct
Когда цикл ПЦР достигает номера цикла значения Ct, он только что вошел в истинный период экспоненциальной амплификации.В настоящее время небольшая ошибка не усиливается, поэтому воспроизводимость значения Ct превосходна, то есть один и тот же шаблон усиливается в разное время или в разных пробирках одновременно.Усиление, полученное значение Ct является постоянным.
1. Эффективность усиления En
Эффективность ПЦР-амплификации относится к эффективности, с которой полимераза превращает ген, подлежащий амплификации, в ампликон.Эффективность амплификации при превращении одной молекулы ДНК в две молекулы ДНК составляет 100%.Эффективность усиления обычно выражается как En.Для облегчения анализа последующих статей кратко представлены факторы, влияющие на эффективность усиления.
| Влияющие факторы | объяснение | Как судить? |
| А. Ингибиторы ПЦР | 1. Матричная ДНК содержит вещества, ингибирующие реакцию ПЦР, такие как белки или детергенты.2. кДНК после обратной транскрипции содержит высокую концентрацию матричной РНК или компонентов реагента ОТ, которые также могут ингибировать последующую реакцию ПЦР. | 1. О наличии загрязнения можно судить путем измерения соотношения А260/А280 и А260/А230 или электрофореза РНК.2. Разводится ли кДНК в определенном соотношении после обратной транскрипции. |
| B. Неправильный дизайн праймера | Праймеры не отжигаются эффективно | Проверьте праймеры на наличие димеров праймеров или шпилек, несоответствий, а иногда и перекрывающихся интронных конструкций. |
| C. Неправильный дизайн программы реакции ПЦР | 1. Праймеры не могут эффективно отжигаться2. Недостаточное высвобождение ДНК-полимеразы 3. Снижение активности ДНК-полимеразы при длительном воздействии высоких температур. | 1. Температура отжига выше значения TM грунтовки2. Слишком короткое время предварительной денатурации 3. Время каждой стадии реакционной процедуры слишком велико. |
| D. Недостаточное смешивание реагентов или ошибки пипетирования | В реакционной системе локальная концентрация компонентов реакции ПЦР слишком высока или неравномерна, что приводит к неэкспоненциальной амплификации амплификации ПЦР. | |
| E. Длина ампликона | Длина ампликона слишком велика, превышает 300 п.н., а эффективность амплификации низкая. | Убедитесь, что длина ампликона находится в пределах 80-300 п.н. |
| F. Влияние реагентов для количественной ПЦР | Концентрация ДНК-полимеразы в реагенте низкая или концентрация ионов в буфере не оптимизирована, в результате чего активность фермента Taq не достигает максимума | Определение эффективности усиления по стандартной кривой |
2. Диапазон значений Ct
Значения Ct варьируются от 15 до 35.Если значение Ct меньше 15, считается, что амплификация находится в пределах базового периода и порог флуоресценции не достигнут.В идеале существует линейная зависимость между значением Ct и логарифмом исходного числа копий шаблона, то есть стандартная кривая.По стандартной кривой, когда эффективность амплификации составляет 100%, расчетное значение Ct для количественного определения числа единичных копий гена составляет около 35. Если оно больше 35, начальное число копий матрицы теоретически меньше 1, что можно считать бессмысленным.
Для разных диапазонов гена Ct из-за различий в количестве копий гена и эффективности амплификации в исходном количестве матрицы необходимо построить стандартную кривую для гена и рассчитать линейный диапазон обнаружения гена.
3. Факторы, влияющие на значение Ct
Из взаимосвязи между количеством циклов амплификации и количеством продукта: количество амплифицированного продукта = количество исходного шаблона × число циклов (1+En), видно, что в идеальных условиях количество исходного шаблона и En будет оказывать негативное влияние на значение Ct.Разница в качестве шаблона или эффективности усиления приведет к тому, что значение Ct будет слишком большим или слишком маленьким.
4. Значение Ct слишком велико или слишком мало
Время публикации: 22 февраля 2023 г.
