Потеря слуха (HL) является наиболее распространенным заболеванием сенсорной инвалидности у людей.В развитых странах около 80% случаев доязыковой глухоты у детей обусловлено генетическими факторами.Наиболее распространены моногенные дефекты (как показано на рис. 1), установлено, что 124 мутации генов связаны с несиндромальной тугоухостью у человека, остальные обусловлены факторами окружающей среды.Кохлеарный имплант (электронное устройство, размещаемое во внутреннем ухе и обеспечивающее электрическую стимуляцию непосредственно слухового нерва) на сегодняшний день является наиболее эффективным вариантом лечения тяжелой ЛХ, в то время как слуховой аппарат (внешнее электронное устройство, преобразующее и усиливающее звуковые волны) может помочь пациентам с ЛХ средней тяжести.Однако в настоящее время нет доступных препаратов для лечения наследственной HL (GHL).В последние годы все большее внимание уделяется генной терапии как перспективному подходу к лечению дисфункции внутреннего уха.

Рисунок 1.Распределение типов вариаций, связанных с глухотой.[1]

Недавно ученые из Института Солка и Университета Шеффилда опубликовали результат исследования в журнале Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], который показал широкие перспективы применения генной терапии наследственной глухоты in vivo.Ури Мэнор, доцент-исследователь Института Солка и директор Центра передовой биофотоники Уэйтта, сказал, что он родился с тяжелой потерей слуха и считает, что восстановление слуха было бы замечательным подарком.Его предыдущее исследование показало, что Eps8 является регуляторным белком актина, обладающим активностью связывания актина и кэпирования;в волосковых клетках улитки белковый комплекс, образованный Eps8 с MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 и GNAI3, в основном присутствует в большинстве кончиков длинных стереоцилий, которые вместе с MYO15A локализуют BAIAP2L2 на кончиках более коротких стереоцилий, необходимых для поддержания пучков волосков.Следовательно, Eps8 может регулировать длину стереоцилий волосковых клеток, что необходимо для нормальной функции слуха;Делеция или мутация Eps8 приводит к коротким стереоцилиям, что делает их неспособными должным образом преобразовывать звук в электрические сигналы для восприятия мозгом, что, в свою очередь, приводит к глухоте..В то же время сотрудник Уолтер Маркотти, профессор Университета Шеффилда, обнаружил, что волосковые клетки не могут нормально развиваться в отсутствие Eps8.В этом исследовании Мэнор и Маркотти объединились, чтобы выяснить, может ли добавление Eps8 к стереоцилиарным клеткам восстановить их функцию и, в свою очередь, улучшить слух у мышей.Исследовательская группа использовала вектор Anc80L65 аденоассоциированного вируса (AAV) для доставки кодирующей последовательности, содержащей EPS8 дикого типа, в улитку Eps8-/- новорожденных мышей P1-P2 путем инъекции мембраны круглого окна;в волосковых клетках улитки мышей функция стереоцилий восстанавливалась до их созревания;а эффект восстановления характеризовался технологией визуализации и измерением стереоцилий.Результаты показали, что Eps8 увеличивает длину стереоцилий и восстанавливает функцию волосковых клеток в низкочастотных клетках.Они также обнаружили, что со временем клетки, по-видимому, потеряли свою способность к спасению с помощью этой генной терапии.Подразумевается, что это лечение, возможно, необходимо будет проводить внутриутробно, поскольку волосковые клетки Eps8-/- могли созреть или накопить повреждения, не поддающиеся восстановлению после рождения мышей.«Eps8 — это белок с множеством различных функций, и еще многое предстоит изучить», — сказал Манор.Будущие исследования будут включать изучение влияния генной терапии Eps8 на восстановление слуха на разных стадиях развития, а также возможность продления возможностей лечения.Так совпало, что в ноябре 2020 года профессор Карен Б. Авраам из Тель-Авивского университета в Израиле опубликовал свои результаты в журнале EMBO Molecular Medicine [3], используя инновационную технологию генной терапии для создания безвредного синтетического аденоассоциированного вируса AAV9-PHP.B. Дефект гена в волосковых клетках мышей Syne4-/- был устранен путем инъекции вируса, несущего кодирующую последовательность Syne4, во внутреннее ухо мышей, что позволило ему проникнуть в волосковые клетки и высвободить переносимый генетический материал, позволив им созреть и нормально функционировать (как на рис. 2).

Рис2.Схематическое изображение анатомии внутреннего уха с акцентом на кортиев орган и клеточную функцию несприна-4.

Видно, что использование генной терапии для достижения цели лечения наследственных заболеваний на генном уровне путем вставки, удаления или коррекции любых мутировавших генов для лечения (то есть контроля генетических изменений при заболевании) имеет высокий клинический эффект.перспективы применения.Современные методы генной терапии генетически дефектной глухоты можно разделить на следующие категории:

замена гена

Замена гена, возможно, является наиболее «прямой» формой генной терапии, основанной на выявлении и замене дефектного гена копией гена нормального или дикого типа.Первое успешное исследование генной терапии внутреннего уха при потере слуха, вызванной делецией гена везикулярного переносчика глутамата 3 (VGLUT3);Опосредованная AAV1 доставка экзогенной избыточной экспрессии VGLUT3 в волосковых клетках внутреннего уха (IHCs) может привести к устойчивому восстановлению слуха, частичному восстановлению морфологии ленточных синапсов и судорожным реакциям [4].Однако в примерах, включающих две замены гена, доставленные AAV, описанные во введении выше, важно отметить, что мышиные модели, используемые для некоторых типов наследственных нарушений слуха с делецией гена, временно отличаются от человеческих, и у мышей P1 внутреннее ухо находится в зрелой стадии развития.Напротив, люди рождаются со зрелым внутренним ухом.Это различие препятствует возможному применению результатов, полученных на мышах, для лечения наследственных нарушений глухоты у человека, если только генная терапия не проводится на зрелых ушах мыши.

Редактирование генов: CRISPR/Cas9

По сравнению с «заменой генов» развитие технологии редактирования генов открыло путь к лечению генетических заболеваний с самого начала.Важно отметить, что метод редактирования генов компенсирует недостатки традиционных методов генной терапии сверхэкспрессии, которые не подходят для доминантных наследственных заболеваний глухоты, и проблему, заключающуюся в том, что метод сверхэкспрессии действует недолго.После того, как китайские исследователи специально нокаутировали мутантный аллель Myo6C442Y у мышей Myo6WT/C442Y с помощью системы редактирования генов AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2, и в течение 5 месяцев после нокаута, у мышей слуховая функция модели была восстановлена;при этом также наблюдали улучшение выживаемости волосковых клеток внутреннего уха, становилась правильной форма ресничек, корректировались электрофизиологические показатели [5].Это первое в мире исследование, в котором используется технология CRISPR/Cas9 для лечения наследственной глухоты, вызванной мутацией гена Myo6, и это важный прогресс в исследованиях технологии редактирования генов для лечения наследственной глухоты.Клинический перевод лечения обеспечивает прочную научную основу.

Методы доставки генной терапии

Чтобы генная терапия была успешной, «голые» молекулы ДНК не могут эффективно проникать в клетки из-за их гидрофильности и отрицательного заряда фосфатных групп, а для обеспечения целостности дополненных молекул нуклеиновых кислот необходимо выбрать безопасный и эффективный метод.Дополненная ДНК доставляется в клетку-мишень или ткань.ААВ широко используется в качестве средства доставки для лечения заболеваний благодаря высокому инфекционному эффекту, низкой иммуногенности и широкой тропности к различным типам тканей.В настоящее время большое количество исследований определило тропизм различных подтипов AAV по отношению к различным типам клеток в улитке мыши.Использование характеристик доставки AAV в сочетании с клеточно-специфичными промоторами может обеспечить клеточно-специфическую экспрессию, что может уменьшить нецелевые эффекты.Кроме того, в качестве альтернативы традиционным векторам AAV постоянно разрабатываются новые синтетические векторы AAV, демонстрирующие превосходную трансдукционную способность во внутреннем ухе, из которых наиболее широко используется AAV2/Anc80L65.Невирусные методы доставки можно дополнительно разделить на физические методы (микроинъекция и электропорация) и химические методы (на основе липидов, полимеров и наночастиц золота).Оба подхода использовались при лечении наследственных нарушений глухоты и показали различные преимущества и ограничения.В дополнение к средству доставки для генной терапии в качестве носителя могут применяться различные подходы к введению генов in vivo, основанные на различных типах клеток-мишеней, способах введения и терапевтической эффективности.Сложная структура внутреннего уха затрудняет доступ к клеткам-мишеням, а распространение агентов редактирования генома происходит медленно.Перепончатый лабиринт расположен внутри костного лабиринта височной кости и включает улитковый проток, полукружный проток, маточку и баллон.Его относительная изоляция, минимальная лимфатическая циркуляция и отделение от крови барьером в виде гематоэнцефалического лабиринта ограничивают эффективную системную доставку терапевтических средств только новорожденным мышам.Чтобы получить вирусные титры, подходящие для генной терапии, необходима прямая локальная инъекция вирусных векторов во внутреннее ухо.Установленные пути введения включают [6]: (1) мембрану круглого окна (RWM), (2) трахеостому, (3) эндолимфатическую или перилимфатическую кохлеостому, (4) мембрану круглого окна плюс фенестрацию трубки (CF) (как на рис. 3).

Рис3.Доставка генной терапии во внутреннее ухо.

Несмотря на то, что в генной терапии было достигнуто много достижений, основанных на клинических трансляционных целях, необходимо проделать большую работу, прежде чем генная терапия сможет стать вариантом лечения первой линии для пациентов с генетическими заболеваниями, особенно в разработке безопасных и эффективных векторов и методов доставки.Но мы верим, что в ближайшем будущем эти виды лечения станут основным продуктом персонализированной терапии и окажут огромное положительное влияние на жизнь людей с генетическими нарушениями и их семей.

Компания Foregene также выпустила высокопроизводительный набор для скрининга целевых генов, который является быстрым и может выполнять обратную транскрипцию и реакции количественной ПЦР без выделения РНК.

Ссылки на продукты

Набор Cell Direct RT-qPCR — Taqman/SYBR GREEN I

Для получения дополнительной информации о продукте, пожалуйста, свяжитесь с:

overseas@foregene.com