Прямая ПЦР — это реакция, в которой для амплификации напрямую используются ткани животных или растений без выделения нуклеиновой кислоты.Во многих отношениях прямая ПЦР работает как обычная ПЦР.

Основное отличие заключается в специальном буфере, используемом в прямой ПЦР, образец может быть непосредственно подвергнут реакции ПЦР без выделения нуклеиновой кислоты, но существуют соответствующие требования к устойчивости ферментов и совместимости буфера, используемого в прямой реакции ПЦР.

Хотя в обычных образцах содержится больше или меньше ингибиторов ПЦР, прямая ПЦР все же позволяет обеспечить надежную амплификацию под действием ферментов и буферов.Для традиционной реакции ПЦР требуется высококачественная нуклеиновая кислота в качестве матрицы, которая может препятствовать плавному протеканию реакции ПЦР, если матрица содержит белки и другие примеси.Прямая ПЦР в настоящее время является одной из самых популярных технологий в области молекулярной диагностики.

01 Прямая ПЦР первоначально использовалась для животных и растений.

Самое раннее применение прямой ПЦР относится к животным и растениям, таким как кровь, ткани и волосы крысы, кошки, курицы, кролика, овцы, крупного рогатого скота и т. д., листья и семена растений и т. д., используемые для изучения генотипирования, трансгенного обнаружения, обнаружения плазмид, анализа нокаута гена, идентификации источника ДНК, идентификации видов, анализа SNP и других областей.

Эти поля имеют некоторые общие черты, то есть содержание целевого гена относительно велико, а выделение нуклеиновых кислот затруднено, поэтому прямая ПЦР может не только сэкономить время и оказать небольшое влияние на результаты, но и снизить затраты.

Прямая ПЦР, используемая для обнаружения патогенов, появилась в последние годы, некоторые производители реагентов для ПЦР приложили много усилий в этом направлении, внедряя инновации.Особенно во время этой эпидемии COVID-19 на рынке появилось много таких продуктов для обнаружения, таких как набор для обнаружения нуклеиновых кислот SARS-CoV-2 (метод флуоресцентного зонда мультиплексной ПЦР), разработанный и разработанный компанией Foregene, который использует технологию RT-PCR в реальном времени (rRT-PCR) для качественного обнаружения нуклеиновых кислот SARS-CoV-2 в образцах мазков из носоглотки или ротоглотки человека.

Foregene — одна из компаний, использующих технологию прямой ПЦР для обнаружения нормальных ORF1ab, N, E ивариант линии нуклеиновых кислот в образцах мазков из носоглотки или ротоглотки человека, таких как линия SARS-CoV-2 B.1.1.7 (Великобритания), линия B.1.351 (ZA), линия B.1.617 (IND) и линия P.1 (BR).

02  Реагенты, необходимые для прямой ПЦР

Образец лизата

Образец лизата можно настроить самостоятельно или приобрести.Разница в составе лизатов разных марок будет обусловливать разную лизирующую способность, а значит и время лизирования будет немного отличаться.Например, для подготовки образцов тканей животных обычно рекомендуется лизис в течение 30 минут или в течение ночи, а раствор для лизиса вирусов составляет от 3 до 10 минут.

Мастер-микс для ПЦР

Рекомендуется использовать ДНК-полимеразу с горячим стартом для усиления специфической амплификации и повышения способности к амплификации.Ядром прямой ПЦР является высокотолерантная полимераза.

Устранение или ингибирование компонентов в образце, влияющих на амплификацию ДНК.

После обработки образца лизатом будут высвобождаться белки, липиды и другие клеточные остатки, эти вещества будут ингибировать реакцию ПЦР.Следовательно, прямая ПЦР требует добавления соответствующих реагентов или ингибиторов, чтобы уменьшить влияние этих факторов.

03  Коллекция из пяти точек знаний прямой ПЦР

Во-первых, технология прямой ПЦР — это технология прямой ПЦР для различных биологических образцов.При этом техническом условии нет необходимости отделять и извлекать нуклеиновую кислоту, непосредственно использовать образец ткани в качестве объекта и добавлять праймеры целевого гена для проведения реакции ПЦР.

Во-вторых, технология прямой ПЦР представляет собой не только традиционную технологию амплификации ДНК-матрицы, но также включает ПЦР с обратной транскрипцией матрицы РНК.

В-третьих, технология прямой ПЦР не только напрямую выполняет рутинные качественные ПЦР-реакции на образцах тканей, но также включает реакции кПЦР в реальном времени, для чего требуется, чтобы реакционная система обладала сильной способностью противодействовать фоновой флуоресценции, а эндогенная флуоресценция подавляла антагонистическую способность.

В-четвертых, образцы, на которые нацелена технология прямой ПЦР, нуждаются только в высвобождении матриц нуклеиновых кислот и не удаляют белки, полисахариды, ионы солей и т. д., которые мешают реакции ПЦР.Для этого требуется, чтобы полимераза нуклеиновых кислот и смесь ПЦР в реакционной системе обладали превосходной устойчивостью и адаптируемостью для обеспечения активности фермента и точности репликации в сложных условиях.

В-пятых, образец ткани, на который нацелена технология прямой ПЦР, без какой-либо обработки обогащением нуклеиновой кислотой, а количество матрицы очень мало, что требует от реакционной системы чрезвычайно высокой чувствительности и эффективности амплификации.