Я считаю, что каждый всегда будет сталкиваться с теми или иными проблемами при проведении ПЦР-реакций, но большинство из них можно разделить на две основные проблемы:

Слишком малая амплификация генной матрицы (амплификация);
Слишком большая амплификация нецелевого гена.
Использование добавок является одной из распространенных стратегий решения этих проблем.Обычно роль добавок имеет два аспекта:
вторичная структурагенов (вторичная структура);
Уменьшить неспецифический прайминг.
Сегодня редактор кратко познакомит вас с обычными добавками в реакциях ПЦР и их функциями.
Добавки, уменьшающие вторичную структуру
сульфоксид(ДМСО)
образцы геновс высоким содержанием ГК.Однако ДМСО также значительно снижает активность полимеразы Taq.Поэтому всем приходится балансировать между доступностью матрицы и активностью полимеразы.Редактор предлагает вам попробовать различные концентрации DSMO, например от 2% до 10%, чтобы найти концентрацию, подходящую для вашего эксперимента.
Неионогенные моющие средства
Неионогенные детергенты, такие как 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 или NP-40, обычно восстанавливают вторичную структуру ДНК.Хотя это может увеличить амплификацию матричного гена, это также вызовет проблемы неспецифической амплификации.Таким образом, эти добавки хорошо работают для реакций ПЦР с низким выходом без дебриса, но не так хорошо для относительно нечистых реакций ПЦР.Еще одним преимуществом неионогенных моющих средств является снижение загрязнения SDS.Обычно в процессе выделения ДНК SDS доводится до стадии ПЦР, что значительно ингибирует активность полимеразы.Поэтому добавление в реакцию 0,5% Твин-20 или Твин-40 может нейтрализовать негативные эффекты ДСН.
Бетаин_
Бетаин может улучшить амплификацию ДНК за счет снижения образования вторичной структуры и обычно является «загадочным» дополнением к коммерческим наборам для ПЦР.Если вы хотите использовать бетаин, вы должны добавить бетаин или моногидрат бетаина (бетаин или моногидрат бетаина), но не гидрохлорид бетаина (бетаин HCl), отрегулировать до конечной концентрации 1-1,7 М.Бетаин также может помочь улучшить специфичность, поскольку он устраняет зависимость плавления/денатурации ДНК от состава пар оснований.
Добавки для снижения неспецифического праймирования
формамид
Формамид является широко используемой органической добавкой для ПЦР.Он может сочетаться с большой и малой бороздками в ДНК, тем самым снижая стабильность двойной спирали основной ДНК и снижая температуру плавления ДНК.Концентрация формамида, используемая в экспериментах с ПЦР, обычно составляет 1-5%.
Тетраметилхлорид аммония( ТМАК)
Хлорид тетраметиламмония может повышать специфичность гибридизации (специфичность гибридизации) и повышать температуру плавления ДНК.Таким образом, TMAC может удалить неспецифический прайминг и уменьшить неправильное связывание ДНК и РНК.Если вы используетевырожденные праймерыв реакции ПЦР не забудьте добавить ТМАЦ, который обычно используется в концентрации 15-100 мМ.
Другие распространенные добавки
В дополнение к двум упомянутым выше категориям добавок, в реакциях ПЦР есть много общих добавок, хотя они имеют разные функции, но также очень важны.
Ион магния
Ион магния является незаменимым кофактором (кофактором) полимеразы, то есть без иона магния полимераза неактивна.Однако слишком много ионов магния также может повлиять на эффективность полимеразы.Концентрация ионов магния в каждой реакции ПЦР будет варьироваться.Хелатирующие агенты (такие как ЭДТА или цитрат), концентрация dNTP и белков влияют на концентрацию ионов магния.Итак, если у вас возникли проблемы с проведением ПЦР-эксперимента, вы можете попробовать изменить разные концентрации ионов магния, например, от 1,0 до 4,0 мМ с интервалом в 0,5–1 мМ.
Стоит отметить, что многократные циклы замораживания-оттаивания могут привести к концентрационному расслоению раствора хлорида магния.Поэтому вы должны полностью растворить его перед каждым использованием и хорошо перемешать перед использованием.
Альбумин бычьей сыворотки(бычий альбумин, БСА)
В экспериментах по молекулярной химии бычий сывороточный альбумин является очень распространенной добавкой, особенно в экспериментах по расщеплению ферментами рестрикции и ПЦР.В реакциях ПЦР БСА полезен для снижения содержания загрязняющих веществ, таких как фенольные соединения.А еще говорят, что он может уменьшить прилипание реагентов к стенке пробирки.В реакции ПЦР обычно концентрация добавляемого БСА может достигать 0,8 мг/мл.
 
Сопутствующие товары:
Герой ПЦР(с красителем)
Герой ПЦР