1. Базовые знания (если хотите посмотреть экспериментальную часть, то переходите сразу ко второй части)
Являясь производной реакции от обычной ПЦР, ПЦР в реальном времени в основном отслеживает изменение количества продукта амплификации в каждом цикле реакции амплификации ПЦР в режиме реального времени посредством изменения сигнала флуоресценции и количественно анализирует исходный шаблон посредством отношения между значением ct и стандартной кривой.
Конкретные данные ОТ-ПЦРисходный уровень, порог флуоресценциииЗначение Кт.
| исходный уровень: | Значение флуоресценции 3-15 цикла является базовым (базовым), что обусловлено случайной ошибкой измерения. |
| Порог (порог): | Относится к пределу обнаружения флуоресценции, установленному в соответствующем положении в области экспоненциального роста кривой амплификации, обычно в 10 раз превышающему стандартное отклонение базовой линии. |
| Значение СТ: | Это количество циклов ПЦР, при котором значение флуоресценции в каждой реакционной пробирке достигает порогового значения. Значение Ct обратно пропорционально количеству исходного шаблона. |
Общие методы мечения для ОТ-ПЦР:
| метод | преимущество | недостаток | Сфера применения |
| СИБР ЗеленыйⅠ | Широкая применимость, чувствительный, дешевый и удобный | Требования к праймеру высокие, склонны к неспецифическим полосам | Он подходит для количественного анализа различных генов-мишеней, исследований экспрессии генов и исследований трансгенных рекомбинантных животных и растений. |
| Такман | Хорошая специфичность и высокая повторяемость | Цена высокая и подходит только для конкретных целей. | Выявление возбудителей, исследование генов лекарственной устойчивости, оценка эффективности препаратов, диагностика генетических заболеваний. |
| молекулярный маяк | Высокая специфичность, флуоресценция, низкий фон | Цена высокая, подходит только для конкретной цели, конструкция сложная, цена высокая. | Специфический анализ генов, анализ SNP |
2. Экспериментальные шаги
2.1 Об экспериментальной группировке- в группе должно быть несколько лунок и должны быть биологические повторы.
| ① | Пустой контроль | Используется для определения состояния роста клеток в экспериментах. |
| ② | Отрицательный контроль миРНК (неспецифическая последовательность миРНК) | Продемонстрируйте специфичность действия РНКи.siРНК может вызывать неспецифический ответ на стресс при концентрации 200 нМ. |
| ③ | Контроль трансфекционных реагентов | Исключить токсичность реагента для трансфекции по отношению к клеткам или влияние на экспрессию гена-мишени |
| ④ | миРНК против гена-мишени | Сбить экспрессию целевого гена |
| ⑤ (необязательно) | положительная миРНК | Используется для устранения неполадок в экспериментальной системе и операционных проблем. |
| ⑥ (необязательно) | Флуоресцентная контрольная миРНК | Эффективность трансфекции клеток можно наблюдать под микроскопом. |
2.2 Принципы построения праймера
| Размер усиленного фрагмента | Желательно 100-150 бп |
| Длина грунтовки | 18-25бп |
| ГХ содержание | 30%-70%, предпочтительно 45%-55% |
| Значение Тм | 58-60℃ |
| Последовательность | Избегайте непрерывного T/C;А/Г непрерывный |
| 3 конечная последовательность | Избегайте богатого GC или богатого AT;концевое основание предпочтительно представляет собой G или C;лучше избегать Т |
| Комплементарность | Избегайте комплементарных последовательностей из более чем 3 оснований в праймере или между двумя праймерами. |
| Специфика | Используйте бласт-поиск для подтверждения специфичности праймера |
①SiRNA видоспецифична, и последовательности разных видов будут разными.
②SiRNA упакована в лиофилизированный порошок, который можно стабильно хранить в течение 2-4 недель при комнатной температуре.
2.3 Инструменты или реагенты, которые необходимо подготовить заранее
| Праймер (внутренняя ссылка) | Включая прямое и обратное два |
| Праймеры (целевой ген) | Включая прямое и обратное два |
| Целевая Si РНК (3 полоски) | Как правило, компания синтезирует 3 полоски, а затем выбирает одну из трех с помощью ОТ-ПЦР. |
| Набор для трансфекции | Липо2000 и др. |
| Набор для быстрого выделения РНК | Для выделения РНК после трансфекции |
| Набор для быстрой обратной транскрипции | для синтеза кДНК |
| Набор для амплификации ПЦР | 2×Супер СИБР Зеленый Мастер-микс для КПЦР |
2.4 Что касается вопросов, на которые необходимо обратить внимание на конкретных экспериментальных этапах:
① процесс трансфекции миРНК
1. Для посева вы можете выбрать 24-луночный, 12-луночный или 6-луночный планшет (предполагаемая средняя концентрация РНК в каждой лунке 24-луночного планшета составляет около 100–300 нг/мкл), а оптимальная плотность трансфекции клеток составляет до 60–80 % или около того.
2. Этапы трансфекции и конкретные требования строго соответствуют инструкциям.
3. После трансфекции образцы могут быть собраны в течение 24-72 часов для обнаружения мРНК (RT-PCR) или обнаружения белка в течение 48-96 часов (WB).
② Процесс выделения РНК
1. Предотвратить загрязнение экзогенными ферментами.В основном это включает строгое ношение масок и перчаток;использование стерилизованных наконечников для пипеток и пробирок для ЭП;вода, используемая в эксперименте, не должна содержать РНКазы.
2. Рекомендуется сделать это дважды, как указано в наборе для быстрой экстракции, что действительно улучшит чистоту и выход.
3. Отработанная жидкость не должна касаться колонки РНК.
③ Количественное определение РНК
После извлечения РНК ее можно количественно определить непосредственно с помощью Nanodrop, а минимальное значение может составлять всего 10 нг/мкл.
④Процесс обратной транскрипции
1. Из-за высокой чувствительности RT-qPCR для каждого образца необходимо сделать не менее 3 параллельных лунок, чтобы последующие Ct не были слишком разными или стандартное отклонение не было слишком большим для статистического анализа.
2. Не замораживайте и не размораживайте мастер-микс повторно.
3. Каждая трубка/отверстие должны быть заменены новым наконечником!Не используйте постоянно один и тот же наконечник пипетки для добавления образцов!
4. Пленка, прикрепленная к 96-луночному планшету после добавления образца, должна быть разглажена планшетом.Лучше всего отцентрифугировать перед установкой на машину, чтобы жидкость на стенке пробирки могла стечь вниз и удалить пузырьки воздуха.
⑤Общий анализ кривой
| Нет периода логарифмического роста | Возможно высокая концентрация шаблона |
| Нет значения ТТ | Неправильные шаги для обнаружения флуоресцентных сигналов; деградация праймеров или зондов – их целостность можно определить с помощью электрофореза в ПААГ; недостаточное количество шаблона; деградация шаблонов – исключение внесения примесей и многократного замораживания и оттаивания при пробоподготовке; |
| Кт>38 | Низкая эффективность усиления;продукт ПЦР слишком длинный;разлагаются различные компоненты реакции |
| Линейная кривая усиления | Зонды могут частично испортиться из-за повторяющихся циклов замораживания-оттаивания или длительного воздействия света. |
| Разница в дублирующих отверстиях особенно велика | Реакционный раствор не полностью расплавлен или реакционный раствор не перемешан;термованна прибора для ПЦР загрязнена флуоресцентными веществами |
2.5 Об анализе данных
Анализ данных qPCR можно разделить на относительную количественную оценку и абсолютную количественную оценку.Например, клетки в группе лечения по сравнению с клетками в контрольной группе,
Сколько раз изменяется мРНК гена X, это относительная количественная оценка;в определенном количестве клеток мРНК гена X
Сколько копий, это абсолютная количественная оценка.Обычно в лаборатории мы чаще всего используем относительный количественный метод.Обычно,метод 2-ΔΔctчаще всего используется в экспериментах, поэтому здесь будет подробно представлен только этот метод.
Метод 2-ΔΔct: полученный результат представляет собой разницу в экспрессии целевого гена в экспериментальной группе по сравнению с целевым геном в контрольной группе.Требуется, чтобы эффективность амплификации как гена-мишени, так и внутреннего эталонного гена была близка к 100%, а относительное отклонение не превышало 5%.
Метод расчета следующий:
Δct контрольная группа = значение ct целевого гена в контрольной группе – значение ct внутреннего эталонного гена в контрольной группе
Δct экспериментальная группа = значение ct целевого гена в экспериментальной группе – значение ct внутреннего эталонного гена в экспериментальной группе
ΔΔct=Δct экспериментальная группа-Δct контрольная группа
Наконец, вычислите кратность разницы в уровне экспрессии:
Change Fold=2-ΔΔct (соответствует функции excel POWER)
Сопутствующие товары:
Время публикации: 20 мая 2023 г.
