Авторы: Ван Сяоянь, Чжао Эрюй

Отделение: больница Цзяочжоу, больница Дунфан при университете Тунцзи

В настоящее время основным типом образца для обнаружения нуклеиновых кислот респираторных патогенов является мазок из зева.Существует много видов широко используемых растворов для сохранения образцов, и все они должны быть охлаждены или заморожены для транспортировки и хранения;Трудно контролировать весь процесс низкой температуры в процессе сбора и транспортировки, а также трудно обеспечить контроль качества перед тестированием образцов.^[1-2].

РНКаза (RNase) — эндонуклеаза, гидролизующая РНК, в основном разрывая фосфодиэфирные связи между нуклеотидами.Молекула РНКазы очень стабильна, в структуре присутствуют дисульфидные связи, а для ее активности не требуется присутствия двухвалентных катионов, поэтому РНКаза плохо денатурируется, легко ренатурируется даже после воздействия высокой температуры или применения денатурантов.РНКазы делятся на эндогенные и экзогенные.Эндогенные РНКазы могут высвобождаться одновременно с разрывом клеток.Поэтому устранение роли эндогенных РНКаз является очень важным шагом в процессе выделения РНК.Экзогенные РНКазы широко распространены.РНКазы существуют в воздухе, коже человека, волосах и слюне, что является важной причиной легкой деградации РНК.^[3].

Запрос данных

CANS-CL02-A009 «Применение Руководства по аккредитации качества и компетентности медицинских лабораторий в области молекулярной диагностики» в технических требованиях предлагает сформулировать соответствующие стандарты качества воды в соответствии с заявкой;Одноразовые герметичные контейнеры:

РНКаза/Классификация

(1) РНКаза А

Рибонуклеаза А (РНКаза А), полученная из бычьей поджелудочной железы, представляет собой эндорибонуклеазу, которая может специфически атаковать 3'-конец пиримидиновых остатков на РНК, разрезая цитозин или урацил, образованные соседними нуклеотидами.Фосфодиэфирная связь, конечным продуктом реакции является 3'-пиримидиновый нуклеотид и олигонуклеотид с 3'-пиримидиновым нуклеотидом на конце.

(2) РНКаза Т1

Рибонуклеаза Т1 (РНКаза Т1) происходит от Aspergillus orjzae, она специфически действует на 3'-концевой фосфат гуанина, а сайт расщепления находится между 3'-фосфатом гуанина и 5'-гидроксилом соседних нуклеотидов.Конечным продуктом реакции являются 3'-гуаниловая кислота и фрагменты олигонуклеотидов с 3'-гуаниловой кислотой на конце.

(3) РНКаза H

Рибонуклеаза Н (РНКаза Н) была впервые обнаружена в ткани тимуса теленка, и кодирующий ее ген был клонирован в Escherichia coli.Он может специфически разлагать ДНК: нити РНК в гибридных дуплексах РНК, в результате чего образуются олигонуклеотиды и мононуклеотиды с 3'-ОН и 5'-монофосфатными концами, он не может разлагать одно- или двухцепочечные ДНК или РНК.

РНКаза

Функция и использование

Рибонуклеаза может катализировать расщепление рибонуклеиновой кислоты (РНК) и может быть синтезирована искусственно.Лекарственная мазь используется местно для лечения травм и болей в суставах.Согласно сообщениям, рибонуклеаза может изменять метаболизм клетки-хозяина, ингибировать синтез вируса, ингибировать пролиферацию вируса гриппа in vitro и ингибировать образование вируса коровьей оспы и герпеса в куриных эмбрионах.Клиническое использование рибонуклеазы ежедневной внутримышечной инъекции 180 мг полезно для лечения эпидемического энцефалита, рибонуклеаза может катализировать деградацию рибонуклеиновой кислоты (РНК) и теперь может быть искусственно синтезирована.Лекарственная мазь используется местно для лечения травм и болей в суставах.Согласно сообщениям, рибонуклеаза может изменять метаболизм клетки-хозяина, ингибировать синтез вируса, ингибировать пролиферацию вируса гриппа in vitro и ингибировать образование вируса коровьей оспы и герпеса в куриных эмбрионах.Клиническое применение рибонуклеазы ежедневно внутримышечно в дозе 180 мг благоприятно для лечения эпидемического энцефалита.

РНКаза

Определение ингибитора

Определение единицы ингибитора РНКазы: количество фермента, необходимое для ингибирования 50% активности 5 нг РНКазы А, составляет одну единицу.

Как работают ингибиторы РНКазы

Гуанидинизотиоцианат:

Изотиоцианат гуанидина представляет собой органическое соединение с молекулярной формулой C2H6N4S.В основном используется в биологической медицине, химических реагентах и ​​т. Д. Изотиоцианат гуанидина является белковым лизирующим агентом и часто используется в качестве основного компонента лизирующего раствора в молекулярных диагностических реагентах.Он может лизировать ткань, разрушать клеточную структуру и отделять нуклеиновую кислоту от нуклеопротеина, а также сильно денатурировать до РНКазы.В настоящее время это самый эффективный ингибитор РНКазы.

TRIzol — это новый реагент для выделения тотальной РНК, который может непосредственно извлекать тотальную РНК из клеток или тканей.Он содержит такие вещества, как фенол и изотиоцианат гуанидина, которые могут быстро разрушать клетки и ингибировать нуклеазы, выделяемые клетками.

(Однако изотиоцианат гуанидина опасен для здоровья исследователей в лаборатории.)

РНазин:

Кислый гликопротеин, экстрагированный из печени крысы или бластодермы человека.Рназин является неконкурентным ингибитором РНКазы, который может связываться с различными РНКазами, инактивируя их.

(Подробнее: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hвысокая температура:

Высокая температура также является распространенным средством денатурации белка.

Диэтилпирокарбонат (DEPC):

DEPC является сильным, но неполным ингибитором РНКазы, который может ингибировать активность РНКазы путем соединения с имидазольным кольцом аминокислоты активной группы РНКазы для денатурации белков.

Ванадилрибонуклеозидный комплекс:

Комплекс, образованный ионами оксида ванадия и нуклеозидами, связывается с РНКазой в виде переходных веществ, способных почти полностью ингибировать активность РНКазы.

другой:

ДСН, мочевина, диатомовая земля и др. также оказывают определенное ингибирующее действие на РНКазу.

Обзоры экспертов

Ли Юцзе Главный техник

Директор лабораторного отделения, больница Цзяочжоу, больница Дунфан, входящая в состав Университета Тунцзи

Чтобы предотвратить биодеградацию экзогенной РНКазы, маски, перчатки и головные уборы следует носить и часто менять во время процесса выделения РНК.Вся стеклянная посуда должна быть высушена в сушильном шкафу при температуре 200°C не менее 2 часов.Материалы, используемые для выпечки, такие как пластик, необходимо обработать водой DEPC, а затем промыть дистиллированной водой.Реагенты или устройства, используемые для выделения, сохранения и идентификации РНК, должны быть предназначены для РНК, и должна быть создана независимая рабочая зона для РНК.

Рекомендации:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Бактерии и вирусы в носоглотке непосредственно перед началом острых инфекций нижних дыхательных путей у детей коренных народов Австралии [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018, 37 (9): 1785-1794.

[2] Отделение больничного инфекционного контроля Китайской ассоциации профилактической медицины.Руководство по сбору и исследованию клинических микробных образцов [J].Китайский журнал госпитальной инфекции, 2018 (20): 3192-3200.

[3] «Клинический тест «Десять тысяч причин молекулярной биологии» Том теста»