Традиционные обратные транскриптазы не переносят высоких температур (оптимальная температура для активности MMLV 37-50°C, а AMV 42-60°C).Более сложная вирусная РНК не может быть эффективно обратно транскрибирована в кДНК при низких температурах, что приводит к снижению эффективности обнаружения.Традиционная RT-qPCR обычно требует участия двух ключевых ферментов (обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы), что не позволяет упростить работу реакционной системы и удешевить ее.Здесь мы представим две устойчивые к высоким температурам обратные транскриптазы, TtH и RevTaq.Эти два фермента также выполняют функцию ДНК-полимеразы, поэтому их называют бифункциональными ферментами.

ДНК-полимераза TtH

Вы, должно быть, слышали о TtH, который происходит от термофильной бактерии Thermus thermophilus HB8.В присутствии двухвалентных катионов, таких как Mg2+, он обладает ДНК-полимеразной активностью.Он широко используется в реакциях ПЦР, как фермент Taq, но обладает более высокой термостойкостью, чем фермент Taq, поэтому он также лучше влияет на ПЦР с матрицами с высоким содержанием GC.

· Этот фермент в основном не обладает 3'→5'-экзонуклеазной активностью и 5'→3'-экзонуклеазной активностью, поэтому его также можно использовать для дидезокси-секвенирования.

· Этот фермент обладает RTase активностью.В присутствии Mn2+ будет усиливаться активность RTase.Используя эту функцию, его можно использовать для проведения реакции обратной транскрипции и реакции ПЦР в одной и той же пробирке, то есть одноэтапной ОТ-ПЦР.Однако в присутствии Mn2+ точность ОТ-ПЦР невысока.Активность ОТ не имеет ничего общего с активностью РНКазы Н.

· Повышенная активность Tth-ДНК-полимеразы (pH9, оптимум +55℃～+70℃, максимум +95℃) преодолевает проблемы, вызванные вторичной структурой РНК.Полученную кДНК можно амплифицировать с помощью ПЦР с тем же ферментом в присутствии ионов Mg2+.

· Способность Tth-ДНК-полимеразы осуществлять обратную транскрипцию и амплификацию ДНК при высоких температурах делает этот фермент полезным для количественной ОТ-ПЦР, клонирования и анализа экспрессии генов клеточной и вирусной РНК.
· Tth-ДНК-полимераза используется для ОТ-ПЦР для амплификации РНК размером до 1 т.п.н.

Особенности и преимущества

Т-я ДНК-полимераза:

• Обеспечьте оптимизированный размер продукта полимеразной цепной реакции (ПЦР), не менее 1000 п.н. в реакции ОТ-ПЦР.

• Принимать модифицированный дезоксирибонуклеозидтрифосфат в качестве субстрата

• Не связано с активностью РНКазы H

• Обладает высокой термической стабильностью для преодоления проблем, обычно связанных с высокой вторичной структурой, присутствующей в РНК.

ДНК-полимераза RevTaq RT-PCR

Термостойкая ДНК-полимераза с обратной транскриптазной активностью

RevTaq-RT-PCR-ДНК-полимераза представляет собой сконструированный высокотермостойкий двухфункциональный фермент с активностью обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы, полученный в результате направленной и искусственной эволюции.

· Период полураспада ДНК-полимеразы RevTaq RT-PCR при 95°C превышает 40 минут.

· ДНК-полимераза RevTaq RT-PCR обеспечивает высокотемпературную обратную транскрипцию непосредственно из матрицы РНК, а этап обратной транскрипции можно повторять несколько раз для создания большего количества матриц кДНК.

· ДНК-полимераза RevTaq RT-PCR позволяет проводить RT-PCR с нулевым шагом (без стадии изотермической обратной транскрипции), поскольку на стадии удлинения циклической ПЦР обратная транскрипция и амплификация ДНК происходят одновременно.Это также способствует реакции обратной транскрипции при высоких температурах, тем самым сводя к минимуму проблемы, возникающие при плавлении прочной вторичной структуры РНК при высоких температурах.

· Благодаря формуле горячего старта на основе аптамера RevTaq RT-PCR ДНК-полимераза будет давать лучшие результаты, когда температура отжига и удлинения выше 57°C.

· Поскольку фермент является термостойким, рекомендуется разрабатывать праймеры и зонды с очень высокой температурой плавления (>60°C).

· Рекомендуется оптимизировать температуру стадии отжига/наращивания за счет температурного градиента в процессе подготовки реакции.

· Чем выше температура, тем выше специфичность ПЦР.Цикл обратной транскрипции обычно проводят при более высокой температуре, чем цикл ПЦР, потому что гибридизация ДНК-праймер:матрица РНК обычно имеет более высокую температуру плавления, чем дуплекс ДНК-праймер:матрица кДНК.

· ДНК-полимераза RevTaq RT-PCR разработана с помощью генной инженерии и оптимизирована, а размер ампликона составляет 60–300 п.н.

Предел обнаружения ДНК-полимеразы RevTaq RT-PCR достигает 4 копий/

Оптимизированная реакционная система (создание высокоплавких праймеров) показана на рисунке.RevTaq RT-PCR RT-PCR, управляемая ДНК-полимеразой, демонстрирует лучшую чувствительность, чем мастер-микс TaqPath 1-step RT-qPCR, и более низкий градиент разведения образца для обнаружения.

Дополнительные преимущества:

Функция быстрого старта → начальный этап термической денатурации можно пропустить.

Формула аптамера с горячим стартом → Немедленно обеспечивает 100% активность фермента и предотвращает неспецифическую амплификацию при низких температурах (<57°C).

Функция расщепления → Этап выделения РНК опущен, поскольку ДНК-полимераза RevTaq RT-PCR также может обрабатывать неочищенные реакционные образцы.Он может немедленно разрушить клеточные мембраны эукариот, бактерий и вирусов в горячем цикле ОТ-ПЦР.

Уровень сырья IVD → высокие стандарты качества и чрезвычайно конкурентоспособные цены