Будучи новичком в лаборатории, не стоит отсеивать положительные растения из группы растений с низким коэффициентом конверсии.Во-первых, ДНК нужно выделять из большого количества образцов один за другим, а затем методом ПЦР выявлять чужеродные гены.Однако результаты часто представляют собой пробелы и полосы, иногда с несколькими элементами, но невозможно определить, есть ли пропущенные обнаружения или ложные обнаружения..Это очень беспомощно перед таким экспериментальным процессом и результатами?Не волнуйтесь, брат научит вас легко и точно отсеивать трансгенные положительные растения.
Шаг 1
Праймеры для обнаружения дизайна
Определите эндогенный ген и экзогенный ген, которые необходимо обнаружить, в соответствии с тестируемым образцом и выберите репрезентативную последовательность 100-500 п.н. в гене для дизайна праймера.Хорошие праймеры могут обеспечить точность результатов обнаружения и сократить время обнаружения (см. приложение для часто используемых праймеров для обнаружения).
Примечание. Недавно разработанные праймеры должны оптимизировать условия реакции и проверить точность, прецизионность и предел обнаружения перед крупномасштабным обнаружением.
Шаг 2
Протокол экспериментального проектирования
Положительный контроль: используйте очищенную ДНК, содержащую целевой фрагмент, в качестве матрицы, чтобы определить, являются ли реакционная система и условия ПЦР нормальными.
Отрицательный/холостой контроль: используйте матрицу ДНК или ddH2O, не содержащую целевой фрагмент, в качестве матрицы для определения наличия источника загрязнения в системе ПЦР.
Внутренний эталонный контроль: используйте комбинацию праймер/зонд эндогенного гена тестируемого образца, чтобы оценить, может ли матрица быть обнаружена с помощью ПЦР.
Уведомление:
Положительные, отрицательные/пустые контроли и контроли внутреннего контроля должны быть установлены для каждого теста, чтобы оценить достоверность экспериментальных результатов.
Подготовка эксперимента
Перед использованием наблюдайте, равномерно ли перемешан раствор.При обнаружении осадка перед применением его нужно растворить и перемешать согласно инструкции.Смесь 2×PCR необходимо пипетировать и многократно смешивать с помощью микропипетки перед использованием, чтобы избежать неравномерного распределения ионов.
Уведомление:
Достаньте руководство и внимательно прочитайте его, а также подготовьтесь к эксперименту в строгом соответствии с требованиями руководства.
Шаг 4
Подготовьте реакционную систему ПЦР
В соответствии с экспериментальным протоколом равномерно смешайте праймеры, H2O и смесь 2 × ПЦР, отцентрифугируйте и распределите их по каждой реакционной пробирке.
Уведомление:
Для крупномасштабных или долгосрочных испытаний рекомендуется использовать реакционную систему ПЦР, содержащую фермент UNG, который может эффективно избежать аэрозольного загрязнения, вызванного продуктами ПЦР.
Шаг 5
Добавить шаблон реакции
Используя технологию прямой ПЦР, нет необходимости в утомительном процессе очистки нуклеиновых кислот, матрица образца может быть подготовлена в течение 10 минут, и может быть добавлена соответствующая реакционная система ПЦР.
Уведомление:
Метод расщепления имеет лучший эффект детекции, и полученный продукт можно использовать для множественных реакций детекции.
5.1: Прямое расширение листьев
В соответствии с размером рисунка в руководстве нарежьте ткань листа диаметром 2-3 мм и поместите ее в реакционную систему ПЦР.
Примечание. Убедитесь, что фрагменты листьев полностью погружены в раствор реакции ПЦР, и не добавляйте чрезмерную ткань листьев.
5.2: Метод разделения листьев
Вырежьте ткань листа диаметром 5-7 мм и поместите ее в центрифужную пробирку.Если вы выбираете зрелые листья, избегайте использования тканей основной жилки листа.Внесите пипеткой 50 мкл лизата буфера P1 в центрифужную пробирку, чтобы убедиться, что лизат может полностью погрузить ткань листа, поместите его в термоциклер или металлическую баню и лизируйте при 95°C в течение 5-10 минут.
Добавьте 50 мкл нейтрализующего раствора Buffer P2 и хорошо перемешайте.Полученный лизат можно использовать в качестве матрицы и добавить в реакционную систему ПЦР.
Примечание. Количество шаблона составляет от 5 до 10 % от системы ПЦР и не должно превышать 20 % (например, в систему ПЦР на 20 мкл добавьте 1–2 мкл лизирующего раствора, но не более 4 мкл).
Шаг 6
ПЦР реакция
После центрифугирования реакционную пробирку для ПЦР помещают в прибор для ПЦР для амплификации.
Уведомление:
В реакции используется неочищенная матрица для амплификации, поэтому количество циклов амплификации на 5-10 циклов больше, чем при использовании очищенной ДНК-матрицы.
Шаг 7
Обнаружение электрофореза и анализ результатов
M: лестница ДНК 100 п.н.
1\4: Метод очищенной ДНК
2\5: прямой метод ПЦР
3\6: Пустой элемент управления
КК:
Результаты испытаний различных контролей, установленных в эксперименте, должны соответствовать следующим условиям.В противном случае следует проанализировать причину проблемы и повторно выполнить тест после устранения проблемы.
Таблица 1. Нормальные результаты тестов различных контрольных групп
* Когда плазмида используется в качестве положительного контроля, результат теста эндогенного гена может быть отрицательным.
Результат решения:
A. Результат теста эндогенного гена образца отрицательный, что указывает на то, что ДНК, пригодная для обычной ПЦР-детекции, не может быть извлечена из образца или выделенная ДНК содержит ингибиторы реакции ПЦР, и ДНК следует экстрагировать снова.
B. Результат теста эндогенного гена образца положительный, а результат теста экзогенного гена отрицательный, что указывает на то, что ДНК, подходящая для обычной ПЦР-детекции, извлечена из образца, и можно судить, что ген XXX в образце не обнаружен.
C. Результат теста эндогенного гена образца положительный, а результат теста экзогенного гена положительный, что указывает на то, что ДНК, пригодная для обычной ПЦР-детекции, была извлечена из образца, а ДНК образца содержит ген XXX.В дальнейшем могут быть проведены подтверждающие эксперименты.
Шаг 8
Праймеры для обнаружения дизайна
После эксперимента используйте 2% раствор гипохлорита натрия и 70% раствор этанола, чтобы протереть экспериментальную зону, чтобы предотвратить загрязнение окружающей среды.
Время публикации: 08 сентября 2021 г.