На мой взгляд, несколько революционных изобретений в истории технологии обнаружения — это технология иммуномаркировки, основанная на принципе специфического связывания антиген-антитело, технология ПЦР и технология секвенирования.Сегодня мы поговорим о технологии ПЦР.В соответствии с развитием технологии ПЦР люди обычно делят технологию ПЦР на три поколения: обычная технология ПЦР, технология количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени и цифровая технология ПЦР.
Cобщепринятая методика ПЦР
КЭРИ МУЛЛИС (1944.12.28-2019.8.7)
Кэри Маллис изобрел полимеразную цепную реакцию (полимеразная цепная реакция, ПЦР) в 1983 году. Говорят, что когда он ехал за рулем своей подруги, его внезапно осенило, и он подумал о принципе ПЦР (о пользе вождения).Кэри Маллис была удостоена Нобелевской премии по химии в 1993 году. The New York Times прокомментировала: «В высшей степени оригинально и значимо, почти разделив биологию на эпохи до и после ПЦР.
Принцип ПЦР: при катализе ДНК-полимеразой ДНК материнской цепи используется в качестве матрицы, а специфический праймер используется в качестве отправной точки удлинения, а ДНК дочерней цепи, комплементарной матричной ДНК материнской цепи, копируется in vitro посредством денатурации, отжига, удлинения и других этапов.Это технология амплификации синтеза ДНК in vitro, которая может быстро и специфически амплифицировать любую ДНК-мишень in vitro.
Преимущества обычной ПЦР
1.Классический метод, полные международные и отечественные стандарты
2.Более низкая стоимость реагентов для приборов
3.Продукты ПЦР могут быть восстановлены для других экспериментов по молекулярной биологии.
Рекомендуемый ПЦР-аппарат Foregene: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Сопутствующие товары: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Недостатки обычной ПЦР
1.легко загрязнять
2.громоздкая операция
3.только качественный анализ
4.Умеренная чувствительность
5.Существует неспецифическая амплификация, и когда неспецифическая полоса имеет тот же размер, что и целевая полоса, ее невозможно различить.
CПЦР на основе апиллярного электрофореза
В ответ на недостатки обычной ПЦР некоторые производители представили приборы, основанные на принципе капиллярного электрофореза.Стадия электрофореза после амплификации ПЦР в капилляре завершена.Чувствительность выше, можно различить разницу в несколько баз и рассчитать усиление по MAERKER.содержание продукта.Недостатком является то, что продукт ПЦР все равно нужно открывать и вводить в прибор, и все равно остается большой риск контаминации.
CапиллярныйEэлектрофорез
2. Технология количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени (Quantitative Real-time PCR, qPCR)Количественная флуоресцентная ПЦР, также называемая ПЦР в реальном времени, представляет собой новую технологию количественного анализа нуклеиновых кислот, разработанную компанией PE (Perkin Elmer) в 1995 году. История развития количественной флуоресцентной ПЦР — это история душераздирающей борьбы таких гигантов, как ABI, Roche и Bio-Rad.Если вы заинтересованы, вы можете проверить это.Этот метод в настоящее время является наиболее зрелым и широко используемым методом полуколичественной ПЦР.
Рекомендуемая машина для количественной ПЦР: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Метод флуоресцентного окрашивания (SYBR Green I):SYBR Green I — наиболее часто используемый ДНК-связывающий краситель для количественной ПЦР, который неспецифически связывается с двухцепочечной ДНК.В свободном состоянии SYBR Green излучает слабую флуоресценцию, но после связывания с двухцепочечной ДНК его флуоресценция увеличивается в 1000 раз.Следовательно, общий флуоресцентный сигнал, испускаемый реакцией, пропорционален количеству присутствующей двухцепочечной ДНК и будет увеличиваться с увеличением количества амплифицированного продукта.Поскольку краситель неспецифически связывается с двухцепочечной ДНК, могут быть получены ложноположительные результаты.
Сопутствующие товары: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Метод флуоресцентного зонда (технология Taqman): Во времяПЦР-амплификация, специфический флуоресцентный зонд добавляют одновременно с парой праймеров.Зонд представляет собой линейный олигонуклеотид с флуоресцентной репортерной группой и флуоресцентной гасящей группой соответственно помеченными на обоих концах.Когда зонд не поврежден, флуоресцентный сигнал, испускаемый репортерной группой, поглощается группой гасителя, и при обнаружении флуоресцентный сигнал отсутствует;во время амплификации ПЦР (на стадии удлинения) активность 5'-3' Dicer фермента Taq будет переваривать и разлагать зонд, так что репортерная флуоресцентная группа и флуоресцентная группа гасителя будут разделены, так что система мониторинга флуоресценции может получить флуоресцентный сигнал, то есть каждый раз, когда амплифицируется цепь ДНК, образуется флуоресцентная молекула, которая реализует полную синхронизацию накопления флуоресцентных сигналов и образования продуктов ПЦР.Метод зонда Такмана является наиболее часто используемым методом обнаружения в клинической диагностике.
Сопутствующие товары: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Преимущества количественной ПЦР
1.Метод отработан, вспомогательное оборудование и реагенты готовы.
2.Средняя стоимость реагентов
3.легко использовать
4.Высокая чувствительность и специфичность обнаружения
Недостатки количественной ПЦР
Мутация целевого гена приводит к пропущенному обнаружению.
Результат обнаружения низкоконцентрированного шаблона не может быть определен.
Существует большая ошибка при использовании стандартной кривой для количественного определения.
3. Технология цифровой ПЦР (digital PCR, dPCR)
Цифровая ПЦР — это метод абсолютного количественного определения молекул нуклеиновых кислот.По сравнению с КПЦР, цифровая ПЦР позволяет напрямую считывать количество молекул ДНК/РНК, что является абсолютным количественным определением молекул нуклеиновой кислоты в исходном образце.В 1999 г. Берт Фогельштейн и Кеннет В. Кинцлер официально предложили концепцию дПЦР.
В 2006 году компания Fluidigm первой выпустила коммерческий прибор для цифровой ПЦР на основе чипа.В 2009 году Life Technologies выпустила системы dPCR OpenArray и QuantStudio 12K Flex dPCR.В 2013 году Life Technologies запустила систему QuantStudio 3DdPCR, в которой используется технология наноразмерных микрожидкостных чипов высокой плотности для равномерного распределения образцов по 20 000 отдельных клеток.в реакционной скважине.
В 2011 году компания Bio-Rad выпустила прибор QX100 dPCR на основе капель, в котором используется технология «вода-в-масле» для равномерного распределения образца до 20 000 капель воды-в-масле, а для анализа капель используется анализатор капель.В 2012 году компания RainDance выпустила прибор RainDrop dPCR, приводимый в действие газом под высоким давлением, для разделения каждой стандартной реакционной системы на реакционную эмульсию, содержащую от 1 до 10 миллионов микрокапель на уровне пиколитров.
До сих пор цифровая ПЦР сформировала две основные фракции: тип чипа и тип капли.Независимо от типа цифровой ПЦР, ее основными принципами являются ограничение разбавления, ПЦР конечной точки и распределение Пуассона.Стандартная реакционная система ПЦР, содержащая матрицы нуклеиновых кислот, равномерно разделена на десятки тысяч реакций ПЦР, которые распределены по чипам или микрокаплям, чтобы каждая реакция содержала как можно больше молекулы матрицы, и выполнялась реакция ПЦР матрицы одной молекулы.Путем считывания флуоресценции подсчитывают наличие или отсутствие сигнала, и после калибровки статистического распределения Пуассона проводят абсолютную количественную оценку.
Ниже приведены характеристики нескольких цифровых платформ ПЦР, которые я использовал:
1. Капельный цифровой ПЦР Bio-Rad QX200 Bio-RadQX200 — очень классическая цифровая платформа для ПЦР, основной процесс обнаружения: 20 000 образцов генерируются генератором капель. Микрокапли воды в масле амплифицируются на обычном ПЦР-аппарате, и, наконец, сигнал флуоресценции каждой микрокапли считывается устройством для считывания микрокапель.Операция более сложная, а риск загрязнения средний.
Микрокапельный цифровой ПЦР Xinyi TD1Xinyi TD1 - это отечественная цифровая платформа для ПЦР, основной процесс обнаружения: генерация 30 000-50 000 капель воды в масле с помощью генератора капель, амплификация на обычном приборе для ПЦР и, наконец, передача. Считыватель капель считывает флуоресцентный сигнал каждой капли.Как генерация капель, так и считывание на этой платформе выполняются в специальном чипе с низким риском загрязнения.
Цифровая ПЦР с микрокапельным чипом STILLA NaicaSTILLA Naica — относительно новая цифровая ПЦР-платформа.Основной процесс обнаружения: добавьте реакционный раствор в чип, поместите чип в систему генерации и амплификации микрокапель и сгенерируйте 30 000 микрокапель.Распространение на чипе, и ПЦР-амплификация завершена на чипе.Затем усиленный чип передается в систему анализа считывания микрокапель, и флуоресцентный сигнал считывается путем фотографирования.Поскольку весь процесс происходит в закрытом чипе, риск загрязнения низок.
4. Цифровой ПЦР-чип ThermoFisher QuantStudio 3D
ThermoFisher QuantStudio 3D — еще одна классическая цифровая ПЦР-платформа на основе чипов.Его основной процесс обнаружения: добавьте реакционный раствор в распределитель и равномерно распределите реакционный раствор на чипе с помощью 20 000 микролунок через распределитель., поместите чип на машину ПЦР для усиления, и, наконец, поместите чип в ридер и сделайте снимок, чтобы прочитать флуоресцентный сигнал.Операция относительно сложная, и весь процесс осуществляется в закрытом чипе, а риск загрязнения низкий.
5. Чип JN MEDSYS Clarity для цифровой ПЦР
JN MEDSYS Clarity — относительно новая цифровая ПЦР-платформа на основе чипов.Его основной процесс обнаружения: добавьте реакционный раствор в аппликатор и равномерно распределите реакционный раствор по 10 000 пробирок для ПЦР, закрепленных в пробирке для ПЦР, через аппликатор.На микропористом чипе реакционный раствор попадает в чип через капиллярное действие, и пробирка для ПЦР с чипом помещается в машину для ПЦР для амплификации, и, наконец, чип помещается в ридер для считывания флуоресцентного сигнала путем фотографирования.Операция более сложная.Риск заражения низкий.
Параметры каждой цифровой ПЦР-платформы резюмируются следующим образом:
Показателями оценки цифровой ПЦР-платформы являются: количество сплит-блоков, количество флуоресцентных каналов, сложность эксплуатации и риск контаминации.Но самое главное – это точность обнаружения.Одним из способов оценки цифровых платформ ПЦР является использование нескольких цифровых платформ ПЦР для проверки друг друга, а другим способом является использование стандартных веществ с точными значениями.
Преимущества дПЦР
1.Достижение абсолютного количественного определения
2.Более высокая чувствительность и специфичность
3.Может обнаруживать образцы с низким уровнем копирования
Недостатки дПЦР1. Дорогое оборудование и реагенты 2. Сложная операция и длительное время обнаружения 3. Узкий диапазон обнаружения
В настоящее время три поколения технологии ПЦР имеют свои преимущества и недостатки, и каждое из них имеет свои области применения, и это не означает, что одно поколение заменяет другое.Непрерывное развитие технологий вдохнуло новую жизнь в технологию ПЦР, позволив ей открывать одно направление применения за другим, делая обнаружение нуклеиновых кислот более удобным и точным.
Источник: Доктор Юань берет вас на тестирование.
Рекомендуемые продукты:
Время публикации: 18 ноября 2022 г.
