• фейсбук
  • связанный
  • YouTube

ПЦР является наиболее широко используемой технологией амплификации нуклеиновых кислот и широко используется благодаря своей чувствительности и специфичности.Однако ПЦР требует повторной термической денатурации и не может избавиться от ограничений, связанных с использованием инструментов и оборудования, что ограничивает ее применение в клинических полевых испытаниях.

С начала 1990-х многие лаборатории приступили к разработке технологии амплификации при постоянной температуре, не требующей термической денатурации.Теперь они разработали технологию изотермической амплификации, опосредованной петлей, технологию изотермической амплификации с заменой цепи, технологию изотермической амплификации с катящимся кругом и зависимость от последовательности нуклеиновой кислоты.Технология изотермического усиления и другие технологии. 

Loop-опосредованная изотермическая амплификация

Принцип амплификации основан на том, что ДНК находится в состоянии динамического равновесия примерно при 65°С.Когда любой праймер образует пару оснований и расширяется до комплементарной части двухцепочечной ДНК, другая цепь диссоциирует и становится одноцепочечной.

При этой температуре ДНК использует 4 специфических праймера, чтобы полагаться на ДНК-полимеразу со смещением нити, чтобы обеспечить непрерывную самоциркуляцию синтеза ДНК со смещением нити.

Сначала определите 6 специфических областей F3, F2, F1, B1, B2, B3 целевого гена, а затем спроектируйте 4 праймера на основе этих 6 специфических областей (как показано на рисунке ниже):

Прямой внутренний праймер (FIP) состоит из F1c и F2.

Обратный внутренний праймер (BIP) состоит из B1c и B2, а TTTT используется в качестве спейсера в середине.

Внешние праймеры F3 и B3 состоят соответственно из областей F3 и B3 гена-мишени.

Технология изотермической амплификации нуклеиновых кислот

В реакционной системе LAMP концентрация внутреннего праймера в несколько раз превышает концентрацию внешнего праймера.Внутренний праймер сначала объединяется с матричной цепью для синтеза комплементарной цепи с образованием двойной цепи ДНК.Затем внешний праймер соединяется с матричной цепью, образуя двойную цепь ДНК.Под действием BstДНК-полимеразы высвобождается комплементарная цепь, синтезируемая внутренним праймером.После ряда реакций комплементарная цепь, наконец, образует единую цепь ДНК с гантелеобразной структурой.

Однонитевая ДНК с гантелеобразной структурой сама по себе используется в качестве матрицы для непрерывного формирования переходной структуры ДНК «стебель-петля» с открытым концом.Внутренний и внешний праймеры направляют ДНК переходной структуры «стебель-петля», чтобы она постоянно подвергалась реакциям смещения и удлинения цепи и, наконец, формировала множественные структуры «стебель-петля» разной длины.Смесь ДНК.

Технология изотермической амплификации нуклеиновых кислот2

Преимущества и недостатки изотермической амплификации, опосредованной петлей

Преимущества ЛАМПЫ:

(1) Высокая эффективность амплификации, которая может эффективно амплифицировать 1-10 копий целевого гена в течение 1 часа, а эффективность амплификации в 10-100 раз выше, чем при обычной ПЦР.

(2) Время реакции короткое, специфичность высокая, специального оборудования не требуется.

Недостатки ЛАМПЫ:

(1) Требования к грунтовкам особенно высоки.

(2) Амплифицированный продукт нельзя использовать для клонирования и секвенирования, а можно использовать только для суждения.

(3) Из-за высокой чувствительности легко образуются аэрозоли, вызывающие ложные срабатывания и влияющие на результаты теста.

Sусиление смещения направления

Амплификация цепей замещения (SDA) — метод изотермической амплификации ДНК in vitro, основанный на ферментативной реакции, впервые предложенный американским ученым Уокером в 1992 году.

Базовая система SDA включает эндонуклеазу рестрикции, ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи, две пары праймеров, dNTP, ионы кальция и магния и буферные системы.

Принцип амплификации с замещением цепи основан на распознавании химически модифицированной рестрикционной эндонуклеазой последовательности на обоих концах ДНК-мишени.Эндонуклеаза открывает разрыв в цепи ДНК в месте ее узнавания, а ДНК-полимераза удлиняет разрыв на 3'-конце и замещает следующую цепь ДНК.

Замещенные одиночные нити ДНК можно комбинировать с праймерами и удлинять в двойные нити с помощью ДНК-полимеразы.Этот процесс повторяется непрерывно, так что последовательность-мишень эффективно амплифицируется.

Технология изотермической амплификации нуклеиновых кислот3

Преимущества и недостатки технологии амплификации замещением нитей

Преимущества СДА:

Эффективность амплификации высокая, время реакции короткое, специфичность высокая, не требуется специального оборудования.

Недостатки ПДД:

Продукты не являются однородными, и некоторые одноцепочечные и двухцепочечные продукты всегда образуются в цикле SDA, и при обнаружении с помощью электрофореза неизбежно возникают хвосты.

Rусиление круга Оллинга

Предлагается амплификация по катящемуся кругу (RCA), основанная на методе копирования ДНК патогенных организмов по катящемуся кругу.Это относится к использованию одноцепочечной кольцевой ДНК в качестве матрицы при постоянной температуре и специальной ДНК-полимеразы (например, Phi29)) Под действием синтеза ДНК с катящимся кольцом для достижения амплификации гена-мишени.

RCA можно разделить на линейное усиление и экспоненциальное усиление.КПД линейных ВКА может достигать 105раз, а эффективность экспоненциального ВКА может достигать 109раз.

Простое различие, как показано на рисунке ниже, линейная амплификация а использует только 1 праймер, экспоненциальная амплификация b имеет 2 праймера.

Технология изотермической амплификации нуклеиновых кислот4

Линейный RCA также называют RCA с одним праймером.Праймер связывается с кольцевой ДНК и удлиняется под действием ДНК-полимеразы.Продукт представляет собой линейную одиночную цепь с большим количеством повторяющихся последовательностей, длина которых в тысячи раз превышает длину одной петли.

Так как продукт линейного RCA всегда подключен к стартовому капсюлю, простота фиксации сигнала является большим преимуществом.

Экспоненциальная RCA, также известная как гиперразветвленная амплификация HRCA (гиперразветвленная RCA), в экспоненциальной RCA один праймер амплифицирует продукт RCA, второй праймер гибридизуется с продуктом RCA и удлиняется, а замена уже связана с продуктом RCA. Нижние праймеры удлиняют цепь и повторяют удлинение и замену для получения дендритного продукта амплификации RCA.

Технология изотермической амплификации нуклеиновых кислот5

Преимущества и недостатки амплификации нуклеиновых кислот по типу катящегося круга

Преимущества РКА:

Высокая чувствительность, хорошая специфичность и простота в эксплуатации.

Недостатки РКА:

Фоновые проблемы во время обнаружения сигнала.Во время реакции RCA нециркулирующий зонд висячего замка и матричная ДНК или РНК несвязанного зонда могут генерировать некоторые фоновые сигналы. 

Nамплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты

Амплификация на основе последовательности нуклеиновых кислот (NASBA) — новая технология, разработанная на основе ПЦР.Это непрерывная и изотермическая амплификация нуклеиновых кислот, управляемая парой праймеров с последовательностью промотора Т7.Технология позволяет амплифицировать матричную РНК примерно в 109 раз примерно за 2 часа, что в 1000 раз выше, чем при использовании обычного метода ПЦР, и не требует специального оборудования.

Эта технология использовалась для экспресс-диагностики заболеваний, как только она появилась, и многие компании в настоящее время используют этот метод в наборах для обнаружения РНК.

Хотя для амплификации РНК также можно использовать технологию ПЦР с обратной транскрипцией, у NASBA есть свои преимущества: ее можно проводить при относительно постоянных температурных условиях, она более стабильна и точна, чем традиционная технология ПЦР.

Реакция протекает при 41 градусе Цельсия и для ее завершения требуется обратная транскриптаза AMV (вирус птичьего миелобластоза), РНКаза H, РНК-полимераза T7 и пара праймеров.

Процесс в основном включает:

Прямой праймер содержит комплементарную последовательность промотора Т7.Во время реакции прямой праймер связывается с цепью РНК и катализируется ферментом AMV с образованием двойной цепи ДНК-РНК.

РНКаза H расщепляет РНК в гибридной двухцепочечной ДНК и сохраняет одноцепочечную ДНК.

Под действием обратного праймера и фермента AMV образуется двойная цепь ДНК, содержащая промоторную последовательность Т7.

Под действием РНК-полимеразы Т7 процесс транскрипции завершается и образуется большое количество РНК-мишени.

Технология изотермической амплификации нуклеиновых кислот6

Преимущества НАСБА:

(1) Его праймер имеет промоторную последовательность Т7, но чужеродная двухцепочечная ДНК не имеет промоторной последовательности Т7 и не может быть амплифицирована, поэтому эта технология обладает высокой специфичностью и чувствительностью.

(2) NASBA напрямую включает процесс обратной транскрипции в реакцию амплификации, сокращая время реакции.

Недостатки НАСБА:

(1) Компоненты реакции более сложные.

(2) Для повышения стоимости реакции необходимы три вида ферментов.


Время публикации: 06 августа 2021 г.