• фейсбук
  • связанный
  • YouTube

1. Определить абсорбцию раствора РНК

Поглощение при 280, 320, 230 и 260 нм представляет значения нуклеиновой кислоты, фона (мутности раствора), концентрации соли и органического вещества, такого как белок, соответственно.Обычно смотрите только на OD260/OD280 (Ratio, R).Когда 1,8~2,0, мы считаем, что загрязнение РНК белком или другим органическим веществом допустимо, но следует отметить, что когда Трис используется в качестве буфера для определения поглощения, значение R может быть больше 2 (обычно оно должно быть <2,2).Когда R<1,8, загрязнение раствора белком или другими органическими веществами более очевидно, и судьбу РНК можно определить в соответствии с потребностями.Когда R>2,2, это означает, что РНК гидролизована до одной нуклеиновой кислоты.
 
2. Электрофоретическая картина РНК
Как правило, для электрофореза РНК используется денатурирующий гель, но если он предназначен только для определения качества РНК, денатурирующий гель не требуется, и можно использовать обычный агарозный гель.Целью электрофореза является определение целостности полос 28S и 18S и их соотношения или целостности мазка мРНК.Как правило, если полосы 28S и 18S яркие, четкие и четкие (относительно четких краев полос), а яркость 28S более чем в два раза превышает яркость полосы 18S, мы считаем качество РНК хорошим.
Вышеупомянутые два метода, которые мы обычно используем, но ни один из этих двух методов не может четко сказать нам, есть ли остаточная РНКаза в растворе РНК.При наличии в растворе очень небольшого количества РНКазы нам трудно ее обнаружить вышеуказанным методом, но большинство последующих ферментативных реакций проводят при температуре выше 37 градусов и длительно.Таким образом, если в растворе РНК будет очень небольшое количество РНКазы, то будет очень подходящая среда и время, чтобы сыграть свою роль в последующих экспериментах, и, конечно, в это время эксперимент будет холодным.Ниже мы представляем метод, который может подтвердить, есть ли остаточная РНКаза в растворе РНК.
 
3. Испытание на сохранение тепла
В соответствии с концентрацией образца, возьмите две 1000 нг РНК из раствора РНК и добавьте его в центрифужную пробирку объемом 0,5 мл и дополните его Трис-буфером с pH 7,0 до общего объема 10 мкл, а затем закройте крышку пробирки.Поместите одну из них в водяную баню постоянной температуры при 70°С и держите ее в тепле в течение 1 часа.Другую часть хранили в холодильнике при -20°С в течение 1 часа.Когда время истекло, удалите два образца для электрофореза.После завершения электрофореза сравните электрофоретические полосы двух.Если полосы этих двух согласуются или не имеют существенной разницы (конечно, их полосы также соответствуют условиям метода 2), это означает, что в растворе РНК нет остаточного загрязнения РНКазой, и качество РНК очень хорошее.Напротив, если в образце, инкубированном при 70°C, наблюдается явная деградация, это указывает на присутствие РНКазы в растворе РНК.
 
2 Экспериментальные методы и приемы выделения РНК
Проблемы, с которыми мы часто сталкиваемся при выделении РНК: (1) выход РНК низкий;(2) РНК имеет серьезное солевое загрязнение;(3) РНК имеет серьезное загрязнение органическими растворителями;(4) деградация образца и другие проблемы
 
1. Обычно используемые реагенты для выделения тотальной РНК
Метод гуанидинизотиоцианата и метод тризола являются наиболее часто используемыми методами выделения тотальной РНК из тканей и клеток животных.Он особенно подходит для небольших образцов и тканей, которые особенно трудно извлечь, например, для выделения тотальной РНК из кожи кролика и соединительной ткани животных;кроме того, Тризол, как лизирующий реагент общего назначения, также может быть использован для экстракции растительных тканей, бактерий, грибов и других тканей.Для растительных тканей, содержащих полисахариды и полифенолы, таких как камелия масличная, листья чая, семена рапса и т. д., метод CTAB также можно использовать для выделения тотальной РНК.

Как традиционный метод, метод с двумя колонками также очень популярен из-за его работы при нормальной температуре, отсутствия необходимости добавления РНКазы и безопасности — без хлороформа, фенолов и других органических реагентов для экстракции.(рекомендуемые продукты )

1
2

2. Извлечение общей РНК из тканей животных
 
(1) Старайтесь выбирать свежую ткань, если она не свежая (желательно в течение трех месяцев - холодильник 80 ℃ или замороженная в жидком азоте. При разрезании ткани не режьте ее непосредственно при комнатной температуре, обязательно кладите ее в ящик для льда, старайтесь избегать повторного замораживания и оттаивания.
(2) Используйте чистые ножницы и пинцет, чтобы отрезать небольшой кусочек ткани, попытайтесь отрезать центральную часть ткани при разрезании образца или сначала отрежьте большой кусок ткани от середины, а затем отрежьте образец в новом месте разреза.Удаленную ткань следует полностью измельчить, поместить измельченную ткань в пробирку для ВП без РНКазы, добавить лизат, измельченную ткань следует полностью подвергнуть воздействию лизата и подготовить к гомогенизации.

(3) Для нормальных тканей выберите ткани размером с бобы мунг (30-60 мг) для гомогенизации.Если ткани содержат большое количество белка, жира или плотных волокнистых тканей, таких как печень, соответствующим образом увеличьте или уменьшите количество разрезаемых тканей (необязательно) Выберите 10~20 мг).
(4) Если извлекаются мышцы рыб, мясо креветок, медузы и другие ткани с высоким содержанием воды, объем образца следует соответствующим образом увеличить (рекомендуется 100–200 мг).
(5) Если позволяют условия, животная ткань может быть извлечена непосредственно после гомогенизации с помощью высокопроходного гомогенизатора тканей, если такое оборудование отсутствует.
(6) РНК, полученная после окончательной экстракции, должна быть немедленно помещена в холодильник, чтобы уменьшить деградацию РНК.

3. Экстракция РНК животных клеток

(1) Суспензия клеток: центрифугировать сразу и удалить среду, промыть стерильным PBS 1-2 раза, затем суспендировать соответствующим количеством PBS, а затем добавить лизат для лизиса.Не добавляйте лизат непосредственно к осажденным клеткам после полного удаления жидкости.Это приведет к тому, что пакет гистонов, высвободившийся после лизиса клеток на внешнем слое, прилипнет к внешней стороне осажденных клеток, тем самым ограничивая контакт клеток внутри осадка с лизатом., что приводит к неполному лизису клеток и снижению выхода РНК.

(2) Клетки, которые являются полуприлипшими или неплотно прилипшими: после удаления среды промыть PBS 1-2 раза, затем непосредственно поглотить соответствующее количество PBS и продуть чашку для культивирования пипеткой или пистолетом, чтобы сдуть клетки и перенести их в клетки, не содержащие РНК.Добавьте лизат в пробирку EP фермента для экстракции.

(3) Адгезивные клетки: сначала необходимо расщепить трипсином, затем собрать в пробирки для EP без РНКазы, центрифугировать для удаления супернатанта, промыть 1–2 раза PBS для удаления избытка трипсина и ресуспендировать с соответствующим количеством PBS. Затем перейти к этапу экстракции.

4. Извлечение РНК растений

Ткани растений богаты фенольными соединениями, или богаты полисахаридами, или содержат неустановленные вторичные метаболиты, или обладают высокой активностью РНКазы.Эти вещества прочно связываются с РНК после лизиса клеток, образуя нерастворимые комплексы или коллоидные осадки, которые трудно удалить.Поэтому, когда мы извлекаем растительную ткань, нам нужно выбрать набор для растений.Лизат в наборе позволяет эффективно решать проблемы легкого окисления полифенолов и разделения полисахаридных соединений и нуклеиновых кислот.

(Для экстракции полисахаридной полифенольной растительной РНК рекомендуемые продукты:

(1) Кожура, мякоть, семена, листья и т. д. растения должны быть полностью измельчены в ступке.Во время процесса измельчения жидкий азот следует вовремя пополнять, чтобы избежать плавления образца.Измельченный образец следует быстро добавить в лизат и встряхнуть, чтобы избежать деградации РНК.

(2) Для образцов с высоким содержанием клетчатки, таких как листья риса и пшеницы, количество экстракции должно быть соответствующим образом уменьшено, иначе измельчение и лизис ткани не будут завершены, что приведет к низкому выходу экстрагированной РНК.

(3) Для растительных тканей с высоким содержанием воды, таких как плоды граната, плоды арбуза, плоды персика и т. д., размер образца должен быть соответствующим образом увеличен (до 100–200 мг).

(4) Ткани растений, такие как листья растений, корневища, твердые плоды и другие материалы, обычно рекомендуется использовать для тщательного растворения ингредиентов в ступке с жидким азотом, а затем перейти к этапу экстракции.Обычные гомогенизаторы тканей могут быть неэффективны при гомогенизации растительных тканей и, как правило, не рекомендуются к использованию.

5. Меры предосторожности при извлечении РНК

(1) Образцы тканей должны быть максимально свежими, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания.

(2) Ткань должна быть полностью измельчена во время экстракции, и количество ткани не должно быть слишком маленьким, не говоря уже о слишком большом.

(3) После добавления лизата должно пройти достаточное время инкубации для полного лизиса образца.

(4) При использовании метода тризола для экстракции принцип поглощения супернатанта после стратификации заключается в том, что «предпочтительнее вдыхать меньше, чем вдыхать больше», и не следует экстрагировать в средний слой, иначе это вызовет серьезное загрязнение геномной ДНК.

(5) При промывке промывочная жидкость должна полностью проникать в стенку трубки, чтобы обеспечить тщательную промывку.

(6) Для метода экстракции колонки, в дополнение к отделению колонки после промывки, адсорбционную колонку также следует поместить в сверхчистую скамью и продуть в течение 5-10 минут, чтобы полностью выпарить органический растворитель досуха.

(7) При последнем элюировании колоночного метода, после добавления воды ДЭПК, ее следует инкубировать в течение 3-5 минут, или воду ДЭПК следует заранее нагреть до 60°C, чтобы увеличить выход элюции.В традиционном методе расщепления тризолом и осаждения изопропанолом конечная РНК растворяется в воде DEPC, поэтому для растворения должно быть отведено соответствующее время, а дно центрифужной пробирки должно непрерывно продуваться наконечником пипетки.

3 Тhree Причины и решения для низкой концентрации РНК/низкого качества
 
1. Урожайность слишком низкая
Извлеченного образца слишком мало, общего количества недостаточно или извлеченного образца слишком много, и лизис не завершен;для экстракции следует использовать ткань или клетки надлежащего качества, предварительная обработка образца должна быть проведена надлежащим образом, а лизис должен быть достаточным.
 
2. Остатки генома
При экстрагировании методом тризола, когда супернатант всасывается в средний слой после расслоения, будет происходить серьезное загрязнение генома;следует соблюдать особую осторожность при наслоении, чтобы избежать всасывания в средний слой.Если для экстракции используется колоночный метод, для экстракции можно выбрать набор, содержащий ДНКазу I.Нуклеиновая кислота, адсорбированная на мембране, непосредственно расщепляется ДНКазой I, что может значительно уменьшить количество остатков ДНК.
 
3. Деградация РНК
Это может быть деградация самого извлеченного образца или деградация, вызванная в процессе экстракции;насколько это возможно, для выделения РНК следует использовать свежие образцы, а собранные образцы следует своевременно хранить в жидком азоте или в холодильнике до -80°C, следует избегать повторного замораживания и оттаивания.В процессе выделения РНК следует использовать наконечники, центрифужные пробирки и другие материалы, не содержащие РНКазы/ДНКазы.Процесс экстракции должен быть максимально быстрым.Извлеченная РНК должна быть помещена в ящик со льдом и храниться при -80 во времени.Если выделенную РНК необходимо обнаружить с помощью гель-электрофореза, электрофорез следует проводить сразу после выделения, а буфер для электрофореза следует заменить новым.
 
4. Остатки соли и органических растворителей
Экстракционные реагенты содержат соли фенола и гуанидина, промывочный раствор – этанол.В процессе экстракции лизат не полностью абсорбировался и выбрасывался, а промывной раствор не полностью осушался.Остаточные соли и органические растворители вредны для последующей обратной транскрипции и ПЦР.Различная степень ингибирования, поэтому лизат ткани должен быть полностью удален в процессе экстракции, а промывка должна быть достаточной, чтобы можно было промыть окружающие стенки пробирки.Кроме того, трубка опорожняется и продувается, что является необходимым шагом, который еще больше уменьшит остаток органического вещества.
 
Для получения дополнительной информации о выделении РНК посетите наш веб-сайт:
www.foreivd.com для получения дополнительной информации.

7

Время публикации: 01 декабря 2022 г.