Количественная флуоресцентная ПЦР (также известная как ПЦР TaqMan, далее именуемая FQ-ПЦР) — это новая технология количественного анализа нуклеиновых кислот, разработанная компанией PE (Perkin Elmer) в США в 1995 г. Эта технология основана на традиционной ПЦР с добавлением флуоресцентно меченных зондов.По сравнению с гибкой ПЦР, FQ-ПЦР имеет много преимуществ для реализации своей количественной функции.Эта статья предназначена для краткого описания характеристик, принципов, методов и приложений технологии.
1 Особенности
FQ-PCR не только обладает высокой чувствительностью, чем обычная ПЦР, но также благодаря применению флуоресцентных зондов она может напрямую обнаруживать изменение флуоресцентного сигнала во время амплификации ПЦР через систему фотоэлектрической проводимости для получения количественных результатов, что преодолевает многие недостатки обычной ПЦР, поэтому она также обладает высокой специфичностью гибридизации ДНК и высокой точностью технологии спектроскопии.
Например, общие продукты ПЦР необходимо наблюдать с помощью электрофореза в агарозном геле и окрашивания бромистым этидием ультрафиолетовым светом или с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и окрашивания серебром.Это требует не только нескольких инструментов, но также требует времени и усилий.Используемые красители бромид этидия вреден для человеческого организма, и эти сложные экспериментальные процедуры создают возможности для загрязнения и ложных срабатываний.Однако для FQ-ПЦР требуется открыть крышку только один раз во время загрузки образца, а последующий процесс представляет собой полностью закрытую пробирку, которая не требует постобработки ПЦР, что позволяет избежать многих недостатков обычных операций ПЦР.В эксперименте обычно используется термоциклер ABI7100 PCR, разработанный компанией PE.
Прибор имеет следующие характеристики: ① Широкое применение: его можно использовать для количественного определения продуктов ПЦР ДНК и РНК, исследования экспрессии генов, обнаружения патогенов и оптимизации условий ПЦР.② Уникальный количественный принцип: при использовании зондов с флуоресцентной меткой количество флуоресценции будет накапливаться с циклом ПЦР после лазерного возбуждения, чтобы достичь цели количественного определения.③ Высокая эффективность работы: встроенный термоциклер 9600 PCR с компьютерным управлением в течение 1–2 часов для автоматического и синхронного завершения амплификации и количественного определения 96 образцов.④ Нет необходимости в гель-электрофорезе: нет необходимости разбавлять и проводить электрофорез образца, просто используйте специальный зонд для обнаружения непосредственно в реакционной пробирке.⑤Отсутствие загрязнения в трубопроводе: используются уникальная полностью закрытая реакционная трубка и система фотоэлектрической проводимости, поэтому не нужно беспокоиться о загрязнении.⑥Результаты воспроизводимы: количественный динамический диапазон составляет до пяти порядков.Поэтому, поскольку эта технология была успешно разработана, она была оценена многими учеными-исследователями и применялась во многих областях.
2 Принципы и методы
Принцип работы FQ-PCR заключается в использовании 5'→3'-экзонуклеазной активности фермента Taq для добавления флуоресцентно меченного зонда в реакционную систему ПЦР.Зонд может специфически гибридизоваться с матрицей ДНК, содержащейся в последовательности праймера.5'-конец зонда помечен геном эмиссии флуоресценции FAM (6-карбоксифлуоресцеин, пик флуоресценции при 518 нм), а 3'-конец помечен группой гашения флуоресценции TAMRA (6-карбокситетраметилродамин, пик эмиссии флуоресценции при 582 нм), 3'-начало зонда фосфорилировано, чтобы предотвратить удлинение зонда во время ПЦР-амплификации.Когда зонд остается интактным, группа гасителя подавляет флуоресцентное излучение излучающей группы.Как только излучающая группа отделяется от группы гашения, ингибирование снимается, а оптическая плотность при 518 нм увеличивается и определяется системой обнаружения флуоресценции. В фазе ренатурации зонд гибридизуется с матричной ДНК, а фермент Taq в фазе удлинения перемещается вдоль матрицы ДНК с удлинением праймера.Когда зонд отключается, эффект гашения высвобождается, и флуоресцентный сигнал высвобождается.Каждый раз, когда шаблон копируется, зонд отрезается, что сопровождается выделением флуоресцентного сигнала.Поскольку между количеством высвобождаемых флуорофоров и количеством продуктов ПЦР существует взаимосвязь один к одному, этот метод можно использовать для точного количественного определения матрицы.В экспериментальном приборе обычно используется термоциклер ABI7100 PCR, разработанный компанией PE, но также могут использоваться и другие термоциклеры.Если для эксперимента используется реакционная система ABI7700, после завершения реакции количественные результаты могут быть получены непосредственно с помощью компьютерного анализа.Если вы используете другие термоциклеры, вам необходимо использовать флуоресцентный детектор для одновременного измерения сигнала флуоресценции в реакционной пробирке для расчета RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ представляет собой отношение интенсивности люминесценции флуоресцентной эмиссионной группы пробирки с образцом к интенсивности люминесценции гасящей группы, RQ- представляет собой отношение двух значений в пустой пробирке, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) представляет величину изменения сигнала флуоресценции во время ПЦР. После обработки данных можно получить количественные результаты.За счет введения флуоресцентных зондов значительно повышается специфичность эксперимента.Конструкция зонда обычно должна соответствовать следующим условиям: ①Длина зонда должна составлять около 20-40 оснований для обеспечения специфичности связывания.② Содержание оснований GC составляет от 40% до 60%, чтобы избежать дублирования последовательностей одиночных нуклеотидов.③ Избегайте гибридизации или перекрытия с праймерами.④ Стабильность связывания между зондом и матрицей выше, чем стабильность связывания между праймером и матрицей, поэтому значение Tm зонда должно быть как минимум на 5°C выше, чем значение Tm праймера.Кроме того, концентрация зонда, гомология между зондом и матричной последовательностью и расстояние между зондом и праймером — все это влияет на экспериментальные результаты.
Сопутствующие товары:
Китай ПЦР в реальном времени Easyᵀᴹ-Taqman Производитель и поставщик |Фореджин (foreivd.com)
Время публикации: 15 октября 2021 г.
