Выдающейся особенностью реакции ПЦР является ее большая мощность амплификации и чрезвычайно высокая чувствительность.Чтобы улучшить производительность ПЦР и эффективность обнаружения, мы стремимся улучшить мощность амплификации ПЦР и чувствительность обнаружения, но головная боль находится в процессе эксперимента.Часто возникают ложноположительные результаты, и очень небольшое перекрестное загрязнение образца или загрязнение продукта ПЦР может вызвать ложноположительные результаты в эксперименте.
Пять типов загрязнения продуктов ПЦР
Существует множество причин загрязнения ПЦР, которые можно условно разделить на следующие категории:
Загрязнение образца в основном вызвано загрязнением контейнера для сбора образца, или когда образец помещается, он вытекает из контейнера из-за неплотной герметизации, или образец прилипает к внешней стороне контейнера, что вызывает перекрестное загрязнение;Загрязнение приводит к загрязнению между образцами;некоторые микробные образцы, особенно вирусы, могут распространяться с аэрозолями или образовывать аэрозоли, что приводит к взаимному заражению.
Основная причина заключается в том, что во время приготовления реагентов для ПЦР пистолет для образцов, контейнер, бидистиллированная вода и другие растворы загрязняются матрицей нуклеиновой кислоты для ПЦР.
В лабораториях молекулярной биологии и некоторых лабораториях, которые используют клонированные плазмиды в качестве положительных контролей, также часто встречается проблема загрязнения клонированными плазмидами.Потому что содержание клонирующей плазмиды в единице объема довольно велико, и в процессе очистки требуется больше инструментов и реагентов, а плазмида в живых клетках с большой вероятностью будет контаминирована из-за сильной способности к росту и размножению живых клеток.
Загрязнение продуктов амплификации является наиболее распространенной проблемой загрязнения в реакциях ПЦР.Поскольку количество копий продукта ПЦР велико (обычно 1013 копий/мл), что намного превышает предел числа копий обнаружения ПЦР, очень небольшое количество загрязнения продукта ПЦР может вызвать ложноположительные результаты.
Аэрозольное загрязнение является наиболее вероятной формой загрязнения продуктов ПЦР, и его также легче всего не заметить.Он образуется в результате трения между поверхностью жидкости и воздухом.Как правило, аэрозольное загрязнение может образовываться при открытии крышки, при аспирации образца или даже при энергичном встряхивании реакционной пробирки.По расчетам, аэрозольная частица может содержать 48 000 копий, поэтому вызываемое ею загрязнение — проблема, заслуживающая особого внимания.
В частности, испытательные лаборатории часто используют одну и ту же пару праймеров для тестирования определенного гена.Со временем в лабораторных помещениях возникнет большое количество загрязнений продуктами ПЦР.После того, как такое загрязнение произошло, его трудно устранить в короткие сроки.
Для первых трех типов загрязнения мы можем использовать эффективные средства, чтобы избежать, но загрязнение, вызванное продуктами ПЦР, трудно предотвратить, особенно при строительстве нестандартных ПЦР-лабораторий.В процессе ПЦР, когда наконечник пипетки всасывает и выдувает жидкость, а крышка пробирки для ПЦР открывается, образуется аэрозоль.Молекулы ДНК, переносимые аэрозолем (один аэрозоль может нести десятки тысяч ДНК), трудно удалить, потому что они парят в воздухе.Как только будет введен следующий раунд экспериментов ПЦР, неизбежно возникнут ложноположительные результаты.
Как показано на рисунке ниже, отрицательный контроль также усиливал соответствующую интересующую полосу:
Здесь представлена первая часть этого выпуска о загрязнении и предотвращении ПЦР.В следующем выпуске вас ждет вторая часть «Предотвращение контаминации продуктов ПЦР», так что следите за новостями!
Время публикации: 25 июля 2017 г.
