Проверка эффективности праймеров и зондов на ранней стадии реагентов ПЦР и определение наиболее подходящих условий реакции являются предпосылками для обеспечения плавного хода формальных экспериментов.
Итак, как нам нужно подтвердить предварительный зонд на ранней стадии?
Основными показателями являются базовый уровень, кривая амплификации, значение ct, эффективность амплификации, обнаружение образца с низкой концентрацией, CV и т. д.
Базовый уровень
Базовая линия представляет собой горизонтальную линию на кривой амплификации ПЦР.В первые несколько циклов реакции амплификации ПЦР сигнал флуоресценции практически не меняется и представляет собой прямую линию.Эта прямая линия является базовой линией.
При скрининге зондов праймеров для ПЦР обратите внимание на то, является ли базовая линия ровной.Чистота концентрации праймер-зонда будет влиять на базовый уровень, например, вызывая повышение или понижение базового уровня.Базовый уровень также является очень интуитивным индикатором.
Кривая усиления
Еще одним интуитивно понятным индикатором является форма кривой усиления.Лучше всего иметь S-образную кривую, чтобы избежать вторичного усиления или других аномальных кривых усиления.
Значение Ct
Количество циклов, соответствующих точке перегиба от базовой линии к экспоненциальному росту, является значением Ct.
Для одного и того же образца разные зонды-праймеры дают разные кривые амплификации, и на соответствующее значение Ct будут влиять эффективность амплификации и степень интерференции.Теоретически, чем меньше значение Ct праймерного зонда, который мы выбираем, тем лучше.
Эффективность усиления
Одним из наиболее надежных и стабильных методов оценки эффективности ПЦР-амплификации является стандартная кривая, также широко признанная исследователями.Метод включает изготовление серии образцов для контроля относительного количества целевых шаблонов.Эти образцы обычно изготавливают путем серийных разведений концентрированных исходных растворов, наиболее часто используемым является 10-кратное разведение.Используя серию разведенных образцов, используя стандартную программу qPCR для амплификации, чтобы получить значение Cq, и, наконец, нарисуйте стандартную кривую в соответствии с концентрацией каждого образца и соответствующим значением Cq, чтобы получить линейное уравнение Cq = -klgX0 + b, и эффективность амплификации E = 10 (-1 / k)-1.При использовании количественной ПЦР для количественного анализа эффективность амплификации должна находиться в диапазоне 90-110% (3,6>k>3,1).
Обнаружение образцов с низкой концентрацией
Когда концентрация образца низкая, уровни обнаружения различных праймеров различаются.Мы выбираем 20 образцов с низкой концентрацией для репликации, и система праймер-зонд с самой высокой скоростью обнаружения является лучшей.
Коэффициент вариации (CV)
10 образцов-дубликатов могут быть обнаружены с помощью различных зондов-праймеров в соответствии с линейным стандартом реагента для обнаружения амплификации нуклеиновых кислот.
Количественные реагенты:
Точность
Точность в пределах одной партии должна удовлетворять: коэффициент вариации (КВ, %) логарифмического значения испытуемой концентрации ≤5%.Когда концентрация образца низкая, коэффициент вариации (CV,%) логарифма концентрации обнаружения составляет ≤10%
Качественные реагенты:
Точность
Точность в пределах одной партии должна соответствовать:
(1) Коэффициент вариации значения Ct (CV,%) ≤5%
Один и тот же образец тестируется параллельно 10 раз, и результаты испытаний должны совпадать.
Время публикации: 18 сентября 2021 г.
