• фейсбук
  • связанный
  • YouTube

На ранней стадии вспышки, в связи с быстрым развитием, быстрая диагностика пациентов с подозрением на COVID-19 является ключом к профилактике COVID-19.Некоторые одобренные реагенты для обнаружения нуклеиновых кислот имеют короткое время разработки, и существуют такие проблемы, как поспешное подтверждение эффективности, недостаточная оптимизация реагентов и большие различия между партиями;Проблемы различных клинических лабораторий в различных аспектах процесса обнаружения нуклеиновых кислот также могут влиять на точность результатов обнаружения нуклеиновых кислот.В этой статье основное внимание будет уделено ключевым звеньям и точкам в текущем обнаружении нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2, а также анализу проблем ложноотрицательного и положительного повторного исследования лабораторного обнаружения нуклеиновой кислоты и клинической несогласованности.

Принципы обнаружения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 представляет собой РНК-вирус с последовательностью генома около 29 т.п.н., с 10 генами, которые могут эффективно кодировать 10 белков.Вирусы состоят из РНК и белка, а самый внешний слой представляет собой внешнюю оболочку, состоящую из липидов и гликопротеинов.Внутри белковый капсид заворачивает в себя РНК, тем самым защищая легко расщепляемую РНК (P1).

zfgd

P1 Структура SARS-COV-2

Вирусы проникают в клетки через специфические рецепторы клеточной поверхности, вызывая инфекцию, и используют клетки-хозяева для репликации.

Принцип обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты заключается в том, чтобы подвергать вирусную РНК воздействию клеточного лизата, а затем использовать для обнаружения флуоресцентную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени.

Ключом к принципу обнаружения является использование праймеров и зондов для достижения «целевого соответствия» последовательностей нуклеиновых кислот, то есть нахождение последовательности нуклеиновых кислот SARS-CoV-2, которая отличается от других вирусов примерно на 30 000 оснований (сходство нуклеиновой кислоты с другими вирусами) «Низкая» область), проектирование праймеров и зондов.

Праймеры и зонды в высокой степени соответствуют специфическому участку нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2, то есть обладают очень высокой специфичностью.Как только результат флуоресцентной амплификации RT-PCR в режиме реального времени для тестируемого образца будет положительным, это доказывает, что в образце присутствует SARS-CoV-2.См. стр.2.

zfgd2

P2 Этапы определения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2 (флуоресцентная ОТ-ПЦР в реальном времени)

Условия и требования лаборатории для обнаружения нуклеиновых кислот SARS-CoV-2

Лаборатории по тестированию нуклеиновых кислот лучше всего подходят для работы в условиях отрицательного давления, и им следует уделять внимание мониторингу давления, обеспечивать подачу воздуха и устранять аэрозоли.Персонал по тестированию нуклеиновых кислот должен иметь соответствующую квалификацию, пройти соответствующую подготовку по полимеразной цепной реакции и пройти аттестацию.Лаборатория должна находиться под строгим контролем, зонироваться, вход постороннего персонала строго воспрещен.Чистая зона должна быть проветрена и продезинфицирована на месте.Соответствующие предметы размещаются в зонах, чистые и грязные отделяются, вовремя заменяются и дезактивируются на месте.Обычная дезинфекция: дезинфицирующее средство, содержащее хлор, является основным раствором для больших площадей, а для небольших площадей можно использовать 75% спирт.Хорошим способом борьбы с аэрозолями является открытие окон для проветривания, также можно проводить обеззараживание воздуха с помощью ультрафиолетовых лучей, фильтрации и обеззараживания воздуха.

Ключевые звенья и параметры определения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2 (флуоресцентная ОТ-ПЦР в реальном времени)

Хотя лаборатории обычно уделяют пристальное внимание «обнаружению» нуклеиновых кислот, на самом деле «извлечение» нуклеиновых кислот также является одним из ключевых шагов для успешного обнаружения, что тесно связано со сбором и хранением образцов вируса.

В настоящее время наиболее широко используемые респираторные образцы, такие как мазки из носоглотки, используют второй метод, который представляет собой раствор для инактивации (консервации), приготовленный на основе экстракции нуклеиновых кислот и раствора для лизиса.С одной стороны, этот раствор для сохранения вируса может денатурировать белок вируса, потерять его активность и больше не быть заразным, а также повысить безопасность этапа транспортировки и обнаружения;с другой стороны, он может непосредственно взломать вирус, чтобы высвободить нуклеиновую кислоту, устранить фермент, разлагающий нуклеиновую кислоту, и предотвратить вирус.РНК деградирует.

Раствор для отбора проб вируса, приготовленный на основе раствора для лизиса экстракции нуклеиновых кислот.Основными компонентами являются сбалансированные соли, хелатирующий агент этилендиаминтетрауксусной кислоты, соль гуанидина (изотиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуанидина и др.), анионное поверхностно-активное вещество (додекан), сульфат натрия), катионное поверхностно-активное вещество (тетрадецилтриметиламмония оксалат), фенол, 8-гидроксихинолин, дитиотреитол, протеиназа К и другие несколько или более компонентов.В настоящее время существует множество типов наборов для выделения нуклеиновых кислот, и используются различные реагенты для выделения и очистки нуклеиновых кислот.Даже если используется один и тот же реагент для выделения и очистки нуклеиновых кислот, процедуры выделения в каждом наборе различаются.

В настоящее время наборы для обнаружения нуклеиновых кислот, одобренные Национальным управлением по продуктам медицинского назначения, выбираются на основе генов ORF1ab, E и N в геноме SARS-CoV-2.Принципы обнаружения различных продуктов в основном одинаковы, но их праймеры и конструкции зондов различаются.Существуют сегменты с одной мишенью (ORF1ab), сегменты с двумя мишенями (ORF1ab, N или E) и сегменты с тремя мишенями (ORF1ab, N и E).Различия между обнаружением и интерпретацией, экстракцией нуклеиновых кислот и системой флуоресцентной ОТ-ПЦР в реальном времени должны относиться к соответствующим инструкциям набора, и пользователям рекомендуется строго следовать методу интерпретации, указанному в инструкциях по интерпретации набора.Общие области, праймеры и последовательности зондов, амплифицированные с помощью флуоресцентной ОТ-ПЦР в реальном времени, показаны на P3.

zfgd3

P3 Расположение ампликона-мишени SARS-CoV-2 в геноме и последовательность праймеров и зондов

Интерпретация результатов определения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2 (Rеал-Tфлуоресцентная ОТ-ПЦР)

«План профилактики и контроля пневмонии при инфекции SARS-CoV-2 (второе издание)» впервые разъяснил критерии оценки результатов амплификации одного гена:

1. Нет Ct или Ct≥40 отрицательный;

2. Ct<37 положительный;

3. Значение Ct от 37 до 40 представляет собой область в оттенках серого.Рекомендуется повторить эксперимент.Если результат переделки Ct<40 и кривая амплификации имеет явные пики, образец считается положительным, в противном случае – отрицательным».

Третье издание руководства и четвертое издание руководства продолжили вышеуказанные критерии.Однако из-за различных мишеней, используемых в коммерческих наборах, вышеупомянутое 3-е издание руководства не содержит критериев для определения комбинации мишеней, подчеркивая, что инструкции, предоставленные производителем, имеют преимущественную силу.Начиная с пятого издания руководства, были уточнены две цели, особенно критерии оценки для одной цели, которую трудно оценить.То есть, если лаборатория хочет подтвердить положительный результат обнаружения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2, необходимо выполнить одно из двух условий:

(1) Две мишени SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) в одном образце дали положительный результат с помощью флуоресцентной ОТ-ПЦР в реальном времени.Если одна цель положительна, требуется повторная выборка и повторное тестирование.Если результаты теста: Если единственная цель все еще положительна, она оценивается как положительная.

(2) Два образца флуоресцентной ОТ-ПЦР в реальном времени показали положительный результат теста на одну цель в одно и то же время, или два образца одного и того же типа показали положительный результат теста на одну цель, который можно расценивать как положительный.Однако в рекомендациях также подчеркивается, что отрицательные результаты тестирования на нуклеиновые кислоты не могут исключать инфицирование SARS-CoV-2.Необходимо исключить факторы, которые могут привести к ложноотрицательным результатам, в том числе плохое качество образцов (респираторные образцы из ротоглотки и других частей), слишком ранний или слишком поздний сбор образцов, неправильное хранение, транспортировка и обработка образцов, проблемы с самой технологией (изменение вируса, ингибирование ПЦР) и т. д.

Причины ложноотрицательных результатов при обнаружении SARS-CoV-2

Понятие «ложноотрицательный» при тестировании на нуклеиновые кислоты, о котором идет речь в настоящее время, часто относится к «ложноотрицательным результатам», при которых результаты теста на нуклеиновые кислоты не соответствуют клиническим проявлениям, то есть клинические симптомы и результаты визуализации вызывают подозрение на COVID-19, но тесты на нуклеиновые кислоты всегда многократно «отрицательны».Клинический лабораторный центр Национальной комиссии здравоохранения объяснил «ложноотрицательный» тест на SARS-CoV-2.

(1) В клетках инфицированного человека имеется определенное количество вируса.Существующие данные показывают, что после заражения организма вирусом вирус попадает в глотку через нос и рот, затем в трахею и бронхи, а затем достигает альвеол.Зараженный человек будет испытывать инкубационный период, легкие симптомы, а затем процесс тяжелых симптомов и разные стадии болезни.И количество вируса, присутствующего в разных частях тела, различно.

С точки зрения вирусной нагрузки типов клеток, альвеолярные эпителиальные клетки (нижние дыхательные пути)> эпителиальные клетки дыхательных путей (верхние дыхательные пути)> фибробласты, эндотелиальные клетки и макрофаги и т. д.;из пробы типа, альвеолярная лаважная жидкость (самая отличная) > мокрота при глубоком кашле > мазок из носоглотки > мазок из ротоглотки > кровь.Кроме того, вирус можно обнаружить и в фекалиях.Однако, учитывая удобство операции и приемлемость для пациентов, обычно используемый клинический порядок взятия образцов следующий: мазок из ротоглотки > мазок из носоглотки > бронхиальный лаваж (сложная операция) и глубокая мокрота (обычно сухой кашель, труднодоступный).

Поэтому количество вируса в клетках ротоглотки или носоглотки у некоторых больных невелико или крайне мало.Если для исследования берутся только образцы ротоглотки или носоглотки, нуклеиновая кислота вируса не будет обнаружена.

(2) Во время сбора образцов не были собраны вируссодержащие клетки, или вирусная нуклеиновая кислота не была эффективно сохранена.

[① Неправильное место сбора, например, при заборе мазков из ротоглотки глубина сбора недостаточна, собранные мазки из носоглотки не собираются глубоко в полости носа и т. д. Большинство собранных клеток могут быть безвирусными клетками;

② Тампоны для отбора проб используются неправильно.Например, синтетические волокна, такие как полиэтиленовое волокно, полиэфирное волокно и полипропиленовое волокно, рекомендуются для материала головки тампона.Натуральные волокна, такие как хлопок, используются в реальной работе (сильное поглощение протеина и его нелегко вымыть) и нейлоновые волокна (плохое водопоглощение, что приводит к недостаточному объему проб);

③Неправильное использование пробирок для хранения вирусов, например неправильное использование полипропиленовых или полиэтиленовых пластиковых пробирок, которые легко абсорбируют нуклеиновые кислоты (ДНК/РНК), что приводит к снижению концентрации нуклеиновой кислоты в растворе для хранения.На практике рекомендуется использовать полиэтилен-пропиленовый полимерный пластик и некоторые специально обработанные полипропиленовые пластиковые контейнеры для хранения вирусных нуклеиновых кислот.]

[① Неправильное место сбора, например, при заборе мазков из ротоглотки глубина сбора недостаточна, собранные мазки из носоглотки не собираются глубоко в полости носа и т. д. Большинство собранных клеток могут быть безвирусными клетками;

② Тампоны для отбора проб используются неправильно.Например, синтетические волокна, такие как полиэтиленовое волокно, полиэфирное волокно и полипропиленовое волокно, рекомендуются для материала головки тампона.Натуральные волокна, такие как хлопок, используются в реальной работе (сильное поглощение протеина и его нелегко вымыть) и нейлоновые волокна (плохое водопоглощение, что приводит к недостаточному объему проб);

③Неправильное использование пробирок для хранения вирусов, например неправильное использование полипропиленовых или полиэтиленовых пластиковых пробирок, которые легко абсорбируют нуклеиновые кислоты (ДНК/РНК), что приводит к снижению концентрации нуклеиновой кислоты в растворе для хранения.На практике рекомендуется использовать полиэтилен-пропиленовый полимерный пластик и некоторые специально обработанные полипропиленовые пластиковые контейнеры для хранения вирусных нуклеиновых кислот.]

(4) Работа клинической лаборатории не стандартизирована.Условия транспортировки и хранения образцов, стандартизированная работа клинических лабораторий, интерпретация результатов и контроль качества являются ключевыми факторами, обеспечивающими точность и надежность результатов испытаний.По результатам внешней оценки качества, проведенной Клиническим лабораторным центром Национальной комиссии здравоохранения 16-24 марта 2020 г., из 844 лабораторий, получивших достоверные результаты, 701 (83,1%) прошли квалификацию, а 143 (16,9%) – нет.Квалифицированные, общие условия лабораторных испытаний хорошие, но разные лаборатории по-прежнему имеют различия в возможностях работы персонала, способности интерпретации положительных образцов с одной целью и контроле качества.

Как уменьшить количество ложноотрицательных результатов при обнаружении нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2?

Сокращение числа ложноотрицательных результатов при обнаружении нуклеиновых кислот должно быть оптимизировано с учетом четырех аспектов получения ложноотрицательных результатов.

(1) В клетках инфицированного человека имеется определенное количество вируса.Концентрация вируса в разных частях тела у подозреваемых в заражении в разное время будет разной.Если глотки нет, то она может быть в промывной жидкости бронхов или кале.Если для тестирования можно собрать несколько типов образцов одновременно или на разных стадиях развития болезни, это поможет избежать ложноотрицательных результатов.

(2) Клетки, содержащие вирус, должны быть собраны во время сбора образцов.Эта проблема может быть решена в значительной степени за счет усиления подготовки сборщиков проб.

(3) Надежные реагенты для диагностики in vitro.Путем проведения исследований по оценке эффективности обнаружения реагентов на национальном уровне и обсуждения существующих проблем можно повысить эффективность обнаружения реагентов и повысить чувствительность анализа.

(4) Стандартизированная работа клинических лабораторий.Усиливая обучение лабораторного персонала, постоянно совершенствуя систему управления качеством в лаборатории, обеспечивая разумное разделение и улучшая способность персонала к обнаружению, можно уменьшить количество ложноотрицательных результатов из-за неправильной работы лаборатории.

Причины повторного положительного результата теста на нуклеиновую кислоту SARS-CoV-2 у выздоровевших и выписанных пациентов

В «Плане диагностики и лечения COVID-19 (пробная седьмая редакция)» четко указано, что одним из критериев для излечения и выписки из больницы пациентов с COVID-19 является наличие двух последовательных образцов из дыхательных путей с отрицательным результатом теста на нуклеиновую кислоту (с интервалом не менее 24 часов), но очень мало тестов на нуклеиновую кислоту SARS-CoV-2 снова были положительными у выписанных пациентов по разным причинам.

(1) SARS-CoV-2 — новый вирус.Необходимо дальнейшее понимание его патогенетического механизма, полной картины вызываемого заболевания и особенностей течения болезни.Поэтому, с одной стороны, необходимо усилить ведение выписанных больных и вести 14-дневное диспансерное наблюдение.Проводить последующее наблюдение, мониторинг состояния здоровья и рекомендации по охране здоровья для углубления понимания всего процесса возникновения, развития и исхода заболевания.

(2) Пациент может снова заразиться вирусом.Академик Чжун Наньшань сказал: «Поскольку у вылеченных пациентов есть антитела, SARS-CoV-2 может быть устранен антителами, когда они снова вторгаются.Существует множество причин, которые могут быть причиной выздоровления пациента, а могут быть связаны с мутацией вируса или даже причиной лабораторных исследований.Если это сам вирус, мутация SARS-CoV-2 может привести к тому, что антитела, вырабатываемые выздоровевшим пациентом, будут неэффективны против мутировавшего вируса.Если пациент снова заразится мутировавшим вирусом, тест на нуклеиновые кислоты может снова дать положительный результат.

(3) Что касается методов лабораторных испытаний, каждый из них имеет свои ограничения.Обнаружение нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2 обусловлено выбором последовательности гена, составом реагентов, чувствительностью метода и другими причинами, приводящими к тому, что существующие наборы имеют свои более низкие пределы обнаружения.После лечения пациента вирус в организме уменьшается.Когда вирусная нагрузка в тестируемом образце ниже нижнего предела обнаружения, появляется «отрицательный» результат.Однако такой результат не означает, что вирус в организме полностью исчез.Вирус может быть после прекращения лечения.Возрождение», продолжайте копировать.Поэтому рекомендуется проводить осмотр один раз в неделю в течение 2-4 недель после выписки.

(4) Нуклеиновая кислота является генетическим материалом вируса.Вирус погибает после того, как больной прошел противовирусное лечение, но оставшиеся фрагменты вирусной РНК все еще сохраняются в организме человека и полностью не выводятся из организма.Иногда, при определенных обстоятельствах, он может быть более сохранен.Длительное время, и в это время тест на нуклеиновые кислоты будет «кратковременно» положительным.С увеличением времени выздоровления пациента, после постепенного истощения остаточных фрагментов РНК в организме, результат теста на нуклеиновые кислоты может стать отрицательным.

(5) Результат теста на нуклеиновую кислоту SARS-CoV-2 доказывает только наличие или отсутствие вирусной РНК и не может подтвердить активность вируса и его трансмиссивность.Необходимо доказать, не станет ли пациент, у которого снова положительный тест на нуклеиновые кислоты, снова стать источником инфекции.Необходимо провести посев вируса на клинических образцах и культивировать «живой» вирус, чтобы доказать, что он заразен.

Краткое содержание

Таким образом, невозможно полностью избежать ложноотрицательных результатов теста на нуклеиновую кислоту SARS-CoV-2, повторного положительного результата теста и других состояний, несовместимых с клиническими проявлениями.При фактическом скрининге и тестировании рекомендуется сочетать клинические симптомы, визуализирующие исследования (КТ) и эксперименты Результаты лабораторных тестов (тест на нуклеиновую кислоту + тест на вирусспецифические антитела) для комплексной диагностики, чтобы предотвратить пропущенный диагноз и ошибочный диагноз.Если обнаружено явное несоответствие результатов теста клиническим проявлениям, рекомендуется провести комплексный анализ всего звена тестирования (звенья сбора проб, циркуляции и обработки), чтобы исключить раннее заражение вирусом SARS-CoV-2, рецидивирующее заражение или сочетание с другими респираторными вирусными инфекциями и т. д. возможно.Если позволяют условия, рекомендуется собрать более чувствительные образцы, такие как мокрота или жидкость альвеолярного лаважа, для повторного исследования.

Сопутствующие товары:

Набор для обнаружения нуклеиновых кислот SARS-CoV-2 (метод мультиплексной ПЦР с флуоресцентным зондом)


Время публикации: 03 сентября 2021 г.